ИСТИНА

Вирус гриппа представляет собой сферическую частицу, оболочка которой формируется белком M1. Транскрипция и репликация генома вируса происходят в ядрах инфицированных клеток, поэтому необходим экспорт собранных новых РНП комплексов из ядра. Эти процессы происходят с участием клеточных белков ядерного экспорта, а также вирусных белков М1 и NEP (белок ядерного экспорта). Структура комплекса NEP и M1 изучена недостаточно. Данные рентгеноструктурного анализа полноразмерных белков отсутствуют. В структуре белка NEP различают чувствительный к протеазам N-концевой домен, а также высокоструктурированный С-концевой домен, который (по данным рентгеноструктурного анализа) состоит из двух альфа-спиралей С1 и С2, соединенных коротким линкером. В образуемой альфа-спиралями шпильке имеется гидрофильный участок, который, предположительно, вовлечен в образование комплекса с белком M1. В этом участке расположен гидрофобный остаток Trp78, окруженный кластером остатков глутаминовой кислоты. Из данных литературы известно, что замена Trp78 на серин приводит к нарушению взаимодействия NEP с белком M1. В связи с этим представлялось целесообразным провести более детальное исследование функциональную значимости этого остатка путем получения новых мутантных вариантов белка с заменой остатка Trp78 на глицин и тирозин. Для получения препаративных количеств белка NEP, а также проведения экспериментов по сайт-специфическому мутагенезу, был использован специально сконструированный экспрессионный вектор с геном белка NEP, содержащим на 3’-конце модуль, кодирующий последовательность His(6) для аффинного выделения белка. Введение целевых мутаций в ген осуществляли методом ПЦР. Белок природной структуры, а также его мутантные варианты экспрессировали в клетках E.coli ER1821. После лизиса клеток и отделения клеточного дебриса белки выделяли из супернатанта методом аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе. Часть белка оказывалась в тельцах включения, из которых после солюбилизации было выделено дополнительное количество белка. Производительность полученного штамма-продуцента – около 2-х мг рекомбинантного белка NEP в 100 мл культуры.