ИСТИНА

Был получен мутантный вариант противоопухолевого цитокина TRAIL DR5-B и конъюгирован с флуо- ресцентной меткой сульфо-Су3-малеимидом по аминокислотному остатку цистеина. Полученный белок DR5-B/V114C-Су3 проявил аналогичную DR5-B цитотоксичность на линии опухолевых клеток НСТ116, а присвязывании с рецептором DR5 интернализировался и накапливался внутри клеток. Ключевые слова: рецептор-селективный цитокин TRAIL DR5-B, флуорофор, сульфо-Cyanine3-малеимид,рецептор смерти DR5, интернализация рецептора Ранее был создан рецептор-селективный вариант TRAIL DR5-B, который селективно связывается с рецептором смерти DR5, не проявляя аффинности к другим рецепторам цитокина (DR4, DcR1, DcR2, OPG). Также было показано, что DR5-B в 2-5 раза эффективнее уничтожает опухолевые клетки по сравнению с TRAIL дикого типа [1]. Целью данной работы было получение модифицированного варианта цитокина для дальнейших функциональных исследований. Был получен мутантный вариант TRAIL DR5-B V114C путем сайт-специфического мутагенеза. Белок DR5-B/V114С был наработан в клетках E. сoli. Очистка проводилась на аффинном сорбенте Ni-NTA с последующей доочисткой на сорбенте SP Sepharose. Далее очищенный белок DR5-B/V114Cбыл конъюгирован с флуорофором сульфо-cyanine3-малеимидом путем инкубации в мольном отношении 1:20 при рН 7-7.5 при комнатной температуре в течение 16 часов. Несвязавшуюся метку отделяли с помощью гель-фильтрации на колонке IllustraNAP-10. Белок DR5-B/V114C-Су3 проявил аналогичную DR5-B цитотоксичность на линии опухолевых клеток НСТ116. Интернализация DR5-B/V114C-Су3 наблюдалась методом флуоресцентной микроскопии в линии клеток НТ29. Было показано, что белок DR5-B/V114C-Су3 при связывании с рецептором DR5 быстро интернализируется и накапливается внутри клеток. Полученный мутантный вариант TRAIL DR5-B с мутацией V114С на N-конце полипептидной цепи позволяет ковалентно конъюгировать белок по аминокислотному остатку цистеина с малеимидными группами различных соединений для функциональных исследований белка, в частности, с флуорофорами, стабилизаторами структуры белка на основе ПЭГ, а также с различными наночастицами и липосомами. Флуоресцентно-меченый белок DR5-B/V114C-Су3 является инструментом для исследования лиганд-опосредованной интернализации рецептора смерти DR5 при активации сигнального пути апоптоза. Литература: 1. Гаспарян М.Э., Бычков М.Л., Яголович А.В., Долгих Д.А. и др. Мутации, повышающие селективность противоопухолевого цитокина TRAIL к рецептору DR5, усиливают его цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам // Биохимия. 2015. №80. С.1080–1091. Финансирование: Работа поддержана грантом РФФИ № 18-34-00812.