ИСТИНА

Сердечная изоформа тропонина I человека (hcTnI) является надежным маркером повреждения кардиомиоцитов, сопутствующего таким серьезным сердечно-сосудистым заболеваниям, как инфаркт миокарда. Моноклональные антитела TnIMAB с высокой аффинностью распознают hcTnI и используются в современных диагностических системах для количественного определения hcTnI в крови. Использование рекомбинантных антител и их фрагментов позволяет усовершенствовать существующие диагностические системы, что представляет собой актуальную биомедицинскую задачу как с научной, так и с прикладной точек зрения. Из-за технической сложности получения полноразмерных рекомбинантых антител для реализации различных научно-практических задач используют главным образом их рекомбинантные фрагменты. Среди таких фрагментов наиболее широко используемыми являются Fab и scFv фрагменты. Fab фрагменты обладают бóльшей аффинностью и стабильностью, а несомненным преимуществом scFv фрагментов является их небольшой размер и экспрессия в виде единственной полипептидной цепи. В связи с этим целью данной работы было получить scFv и Fab фрагменты и сравнить их выход при получении, биохимические и иммунохимические свойства между собой, а также с полноразмерными антителами. Участки генов легкой цепи и тяжелой цепи, соответствующие scFv и Fab фрагментам, были встроены в плазмиды pET22b+ и pET23a+ для получения конструкций как для экспрессии в растворимой, так и в нерастворимой форме. Однако при экспрессии и Fab, и scFv фрагменты были обнаружены в нерастворимой фракции. Выход очищенных иммунохимически активных scFv фрагментов составил 5 мг/л культуральной среды, а Fab фрагментов – 2,5 мг/л. Аффинность (KD) антител, определенная методом поверхностного плазмонного резонанса, составила около 3 нМ и достоверно не отличалась у рекомбинантных Fab, scFv и Fab фрагментов, полученных энзиматически. При использовании в различных детектирующих системах («сэндвич» с прямой сорбцией scFv/Fab на подложку, «сэндвич» с сорбцией биотинилированных scFv/Fab на стрептавидиновые планшеты, детекция hcTnI scFv/Fab фрагментами, конъюгированными с хелатом европия) scFv и Fab фрагменты уступают полноразмерным антителам, что может быть связано с их авидностью. Таким образом, наши исследования показывают, что рекомбинантные scFv и Fab фрагменты, специфичные к hcTnI, обладают всеми необходимыми иммунохимическими свойствами для их использования в диагностических системах.