ИСТИНА

Мембранный гемопротеин простагландин-H-синтаза (PGHS) осуществляет ключевой этап синтеза простагландинов – медиаторов боли и воспаления, других важных физиологических процессов. Циклооксигеназная реакция фермента, в ходе которой арахидоновая кислота окисляется двумя молекулами кислорода и превращается в простагландин G2 (PGG2), ингибируется нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП). Для исследования использовали PGHS-1 из везикулярных желез барана. Фермент солюбилизировали из мембран с помощью неионного детергента твина-20. Мицеллы твина-20 составляют органическую фазу водно-мицеллярной системы, в которой работает PGHS in vitro. Из нативного холофермента получали апофермент методом восстановления гемового железа дитионитом натрия в анаэробных условиях и дальнейшего окисления кислородом. Взаимодействие апофермента с гемом и холофермента с ингибитором напроксеном исследовали методом детекции циклооксигеназной активности (по скорости расходования растворенного кислорода) при различном содержании твина-20 в реакционной среде. Полученные данные анализировали с помощью пакетов Origin и MATLAB. Влияние содержания твина-20 можно описать в рамках модели распределения гидрофобных веществ (арахидоновая кислота, гем, напроксен) между водной и органической (мицеллы твина-20) фазами с соответствующими коэффициентами распределения (P). Ранее мы оценили коэффициент распределения арахидоновой кислоты (PAA >> 1000), а также истинное значение константы Михаэлиса в гидрофобной фазе для арахидоновой кислоты (KM = 5400 мкМ). Используя эти значения, мы оценили коэффициенты распределения гема и напроксена между водной и гидрофобной фазами, а также истинные значения констант диссоциации комплексов апофермент-гем (K) и холофермент-напроксен (K1, K2 и коэффициент γ, описывающий кооперативность) в предположении, что взаимодействие с белком происходит через гидрофобную фазу. Определение влияния гидрофобной фазы и нахождение истинных констант важно для сопоставления результатов, полученных в разных экспериментальных условиях, и для использования полученных данных для описания поведения фермента in vivo. Подобный подход может быть использован и для других мембранных ферментов, работающих в двухфазных водно-органических системах. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-04-00737а.