ИСТИНА

Термин амилоидоз обозначает группу заболеваний, вызванных неправильно свернутыми белками, которые накапливаются в определенных тканях и органах и приводят к нарушению их нормальных функций. Амилоидоз сопутствует диабету второго типа, атеросклерозу, болезням Альцгеймера, Паркинсона и др. Неправильно свернутые белки могут терять свои нативные свойства и образовывать нерастворимые агрегаты, которые называются амилоидными фибриллами и характеризуются структурой, богатой бета-листами. Они могут достигать 10-20 нм в диаметре и нескольких микрометров в длину. Тема образования амилоидных фибрилл является одной из наиболее актуальных тем в биохимии, молекулярной биологии и медицине. Одним из наиболее распространённых маркеров для детектирования амилоидных фибрилл и исследования кинетики их образования является тиофлавин Т (ThT). Данный краситель специфически встраивается в фибриллярные агрегаты, при этом квантовый выход его флуоресценции возрастает на 3 порядка по сравнению с водным раствором, среднее время жизни флуоресценции возрастает от 200 пс до 2 нс. Фотофизические аспекты формирования оптических свойств тиофлавина Т при связывании его в фибриллярные агрегаты активно изучаются. Одна из общепринятых гипотез утверждает, что тиофлавин Т встраивается в фибриллы по принципу молекулярного ротора так, что усиление квантового выхода флуоресценции, сопровождающее данный процесс, вызвано жесткой фиксацией молекулярных фрагментов зонда. В водном растворе после фотовозбуждения происходит сверхбыстрая релаксация, связанная с внутримолекулярным переносом заряда (ВЗП) с последующей торсионной релаксацией. Ограничение этого вращения в жесткой микросреде предотвращает поворот колец и, следовательно, снижает эффективность нерадиационного распада, связанного с ВЗП, что приводит к одновременному увеличению интенсивности флуоресценции и времени жизни. Данная гипотеза была также проверена в работах по исследованию изменения фотофизических параметров тиофлавина Т в средах с различной вязкостью. Однако, теория «молекулярного ротора» не объясняет несовпадение кинетики изменения среднего времени жизни тиофлавина Т при встраивании в фибриллы и изменения интенсивности флуоресценции зонда при фибрилообразовании. В работе с помощью метода ап-конверсии было показано наличие двух различных мод встраивания красителя. Фотофизческие характеристики тиофлавина Т в данных сайтах различаются значительно: среднее время жизни флуоресценции зонда, встроенного в сайт со слабым связыванием, составляет 2 нс, а для сайта с высокой афинностью - 2 пс. Более того, существует ряд работ, в которых продемонстрирована способность нативных белков связывать тиофлавин Т, сопровождающаяся ростом среднего времени жизни до значения около 1 нс, сравнимого с данным параметром для системы фибриллы-ThT, и всего лишь десятикратным усилением флуоресценции красителя. Таким образом, возникает необходимость более детально исследовать процесс связывания тиофлавина Т в различные системы, определить параметры мод встраивания и изменение фотофизических характеристик ThT в результате данного процесса. Данная работа посвящена изучению оптических свойства ThT в ряде систем с различной структурой: (1) фибриллярные агрегаты; (2) префибриллярные агрегаты, являющиеся наиболее токсичными для организма человека, (3) различные глобулярные белки и их неспецифические агрегаты. С использованием стационарной и время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии для всех исследуемых структур были определены константы образования комплекса с зондом, среднее время жизни флуоресценции и усиление флуоресценции тиофлавина Т. С использованием метода ап-конверсии были исследованы фотофизические характеристики при связывании зонда в белки и белковые агрегаты. Данные результаты позволят продвинуться в понимании механизма связывания красителя с различными объектами и предоставят новые возможности мониторинга процессов агрегации с использованием ThT.