ИСТИНА

Тромбоциты – циркулирующие в крови безъядерные клеточные фрагменты, которые выполняют важнейшую функцию предотвращения кровотечений при повреждении сосуда. Для этого тромбоциты способны к активации – комплексу процессов, включающих приобретение способности к агрегации, адгезии, изменению формы, выбросу гранул с активаторами и переходу в прокоагулянтное состояние. Управляющим внутриклеточным сигналом активации тромбоцита является изменение концентрации ионов кальция в цитозоле [1]. Известно, что в клетках пациентов с мутациями, приводящими к аномальным размерам тромбоцитов и концентрациям АТФ, наблюдаются отклонения в динамике концентрации внутриклеточного кальция, поэтому механизм, который мог бы описывать такие отклонения, также вызывает большой интерес. Цель данной работы – определение молекулярных механизмов формирования кальциевого ответа в тромбоцитах человека. Для решения были поставлены следующие задачи: во-первых, на основании экспериментальных данных количественно и качественно описать форму кальциевых пиков для здоровых доноров; во-вторых, построить математическую модель динамики концентрации кальция в тромбоците, которая бы описывала форму кальциевых пиков, наблюдаемую в эксперименте; в-третьих, сделать предсказания о том, как изменится поведение модели при изменении объема клетки и концентрации АДФ. Для получения данных о динамике концентрации кальция в одиночных тромбоцитах здоровых доноров, загруженных флуоресцентными зондами на ионы кальция, использовалась скоростная киносъемка, примененная к микроскопии полного внутреннего отражения. Применялись проточные камеры с конструкцией, обеспечивающей специфическую адгезию тромбоцитов к подложке и динамическую смену растворов. Для интегрирования и анализа модели использовались пакеты Python 3.6 PyDSTool, NumPy и SciPy. Для здоровых доноров были поставлены серии экспериментов по определению кинетики кальциевого ответа одиночных тромбоцитов, иммобилизованных на нейтральной или активирующей подложке. По ответу одиночные тромбоциты могут быть разделены на три качественно различных категории: постоянная низкая концентрация кальция, осцилляции концентрации кальция и постоянно высокая концентрация кальция в цитозоле. Более половины тромбоцитов во всех случаях демонстрировали осцилляции. Несимметричная форма спайка концентрации кальция в этих осцилляциях является наиболее характерной с коротким временем возрастания и длительным временем убывания. При этом было показано, что среди всех параметров спайка, наименее меняющимися от донора к донору оказались ширина спайка и времена роста и спада, которые составили 1.5 ± 0.5, 0.5 ± 0.25 и 1.2 ± 0.4 с, соответственно. В всех случаях скорость спада кальциевого пика превышала скорость роста, то позволило подтвердить первоначальное наблюдение о том, что форма кальциевого спайка асимметрична. Для описания полученных экспериментальных данных была модифицирована модель Кайзера – де Янга [2]. Для описания формы кальциевого спайка был произведен учет кооперативности работы рецепторов к инозитолтрифосфату вкупе с включением в модель буферизации ионов кальция в цитозоле и эндоплазматическом ретикулуме. В результате интегрирования модели было показано, что уменьшение объема клетки и значения параметра, связанного с внутриклеточной концентрацией АТФ, приводит к росту частоты осцилляций и среднего уровня концентрации кальция в тромбоците. В результате работы можно сделать вывод, что частота осцилляций концентрации кальция и форма одиночных спайков определяются буферизацией ионов кальция в цитозоле клетки и, возможно, кооперативной работой рецепторов к инозитолтрифосфату. Работа поддержана грантом РНФ №17-74-20045