ИСТИНА

На современном этапе развития почвенной микробиологии достигнуты большие успехи в определение таксономического состава микробных сообществ почв и почвоподобных субстратов (классические методы посева почвенных суспензий на питательные среды, современный молекулярно-генетические: создание библиотек клонов, денатурирующий градиентный гель-электрофорез и т.д.). Тем не менее, проблема оценки физиологического состояния и активности микроорганизмов не столь хорошо проработана. Следует подчеркнуть, что именно от физиологического состояния микроорганизма, а не только от количества зависит его вклад в микробиологические процессы, проводимые микробным комплексом исследуемой почвы. Имеющиеся подходы, основанные на определение ферментативной активности почв, на дифференцирующем окрашивание живых и мертвых клеток микроорганизмов (красители Leaf-dead и т.д.) не дают достаточной информации о физиологическом состояние различных групп микроорганизмов, поэтому необходимо дальнейшее совершенствование методов исследования. В основе предлагаемого метода лежит тот давно известный факт о том, что продолжительность лаг-фазы микроорганизмов определяется не только параметрами питательной среды и условиями инкубирования, но и предысторией культуры микроорганизмов, отражающейся в физиологическом состоянии. Предполагается, чем короче лаг-фаза роста микроорганизма в питательной среде, тем, с одной стороны, в более активном состоянии находился организм в природной среде и тем больше, с другой стороны, его ферментная система готова к потреблению органического субстрата, находящегося в питательной среде. Последнее зависит от того потребляли этот органический субстрат микроб в природе до того как попал на искусственную питательную среду. Суть метода заключается в определении физиологического состояния микроорганизмов по кривой начального роста (лаг-фаза и фаза нелимитированного роста) на жидких питательных средах. Теоретическим основание для данного подхода является предложенный классиком почвенной микробиологии С.Н. Виноградским метод спонтанной почвенной микробной культуры, кинетический метод определения микробной биомассы в почве по С.Н. Паникову, математическое описание роста заимствуется из синтетической хемостатной модель (СХМ),упрощенной для описания лаг-фазы и фазы нелимитированного роста периодической культуры микроорганизмов (Паников, 1991). Уравнение роста имеет вид: x(t)=x0( 1 -ro+rnex :p(//«t)), где х - биомасса микроорганизмов (оптические единицы) в момент времени t (ч), хо - биомасса в начальный момент времени, /^-максимальная удельная скорость роста (ч"1), го- переменная физиологического состояния микроорганизмов в нулевой момент времени, т.е. в почве на момент проведения эксперимента. Увеличение численного значения го свидетельствует о большей активности микроорганизмов. Поскольку на жидких питательных средах вырастали смешанные популяции, то получаемые параметры получаются усредненными для всего сообщества, растущего на той или иной среде. Технические реализация метода заключается во внесении почвенной суспензии микроорганизмов (бактерий) в лунки 96-луночной планшеты для иммунологических тестов, содержащий набор питательных сред, с последующей инкубацией в течение определенного времени (до 250 часов). Поскольку регистрация роста проводится оптическим методом, применимом только для бактерий, подавление роста грибов достигается внесением нистатина в исходную почвенную суспензию. Регистрация роста проводится в автоматическом режиме в динамике на иммуноферментном анализаторе Sunrise фирмы Тесал. Органические субстраты для выращивания микроорганизмов подбираются по их функциональной значимости для микробного сообщества. Это распространенные биополимеры: крахмал, целлюлоза, хитин, казеин, пектин, ксилан, твин 20, мономеры - сахара, аминокислоты, так же некоторые органические кислоты; список субстратов определяется конкретными задачами эксперимента. Для апробации метода были поставлены следующие задачи и выбраны следующие объекты: 1)Установить физиологическое состояние бактерий и их готовность потреблять биополимеры в верховых торфах в сравнение с низинными. 2) Проследить изменение, активности бактерий - полимероразлагателей при пассаже их через пищеварительный тракт дождевых червей Eisenia foetida andrei (Bouche, 1972) на основе анализа корма червей и свежих копролитов 3) Исследовать различные типы хозяйственного использования чернозема (пашня-лесополоса) на физиологическое состояние бактерий в различных фракциях водопрочных агрегатов чернозема Курская обл. 4) Определить состояние бактерий для оценки экологического состояния городских почв. Результаты, полученные в ходе экспериментальной работы и частично представленные на рисунке, свидетельствуют о том, что использование нового технологического метода предполагает и иной уровень обработки данных, который основывается на методах непараметрической статистики, так как распределение частот встречаемости значений в пределах выборки не подчиняется гаусовскому распределению. Поэтому для представления результатов были применены медиана и квартили. Результаты носили закономерный не случайный характер. Так для торфов отмечена четкая трофическая адаптация бактериального блока к условиям среды. Для бактерий низинного торфа характерна готовность потреблять растительный полимер крахмал. Для верхового - ацетат и пектин. Физиологическое состояние бактерий, растущих на спектре органических субстратов (медиана, квартили) в торфе (а), в различных фракциях водопрочных агрегатов курского чернозема (б, в). Несмотря на снижение поступления растительных биополимеров под пашней бактерий полимероразлагателей в агрегатах чернозема сохраняются в активном состояние (рисунок, б, в). Зарегистрирована большая метаболическая готовность бактерий (выше го) потреблять большинство полимеров и мономеров во фракции <0.1 мм под лесополосой по сравнению с аналогичной фракцией пашни. Возможно именно в эту фракцию поступает свежее органическое вещество, доступное для микробного разложения. При пассаже через пищеварительный тракт дождевых червей наблюдается резко снижение готовности потреблять пектин, крахмал, глюкозу. Специфика в спектре ассимиляции прослеживается и у городских почв по градиенту загрязнения от автодороги. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 08-04-00786-а, № 10- 04-00415, № 08-04-00656 и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, госконтракт П1325 от 11 июня 2010г.