ИСТИНА

Сайт-специфические никазы – ферменты, способные узнавать в ДНК определенную последовательность (сайт) и вносить одноцепочечный разрыв рядом с ней. Никазы нашли широкое применение в качестве инструмента в молекулярной биологии. Однако возможность их применения ограничена малым числом сайтов, которые узнают никазы, выделенные из природных источников. Решением этой проблемы может быть получение никаз с новой специфичностью, что требует точных знаний о механизмах взаимодействия белка с ДНК. Для никазы BspD6I решена кристаллическая структура, определены узнающий и каталитический домены фермента [2]. Целью данной работы является выяснение значения одной из ключевых аминокислот никазы BspD6I – Cys11, предположительно находящегося на поверхности ДНК-связывающего кармана. Три других остатка цистеина локализованы внутри белковой глобулы и, по-видимому, не взаимодействуют с ДНК. В нашей научной группе разработан эффективный способ аффинной модификации ДНК-связывающих белков с помощью ДНК-дуплексов, содержащих йодацетамидную функцию в 2´-положении одного из нуклеотидных звеньев [1]. В данной работе синтезированы пять 26-звенных олигонуклеотидов с этой модификацией. Олигонуклеотиды ацилировали ангидридом йодуксусной кислоты, затем добавляли комплементарную цепь и подвергали смесь тепловой денатурации-ренатурации. Реакционная группировка находится в сайте узнавания никазы или на некотором расстоянии от него. Показано, что никаза сохраняет способность к специфическому связыванию с модифицированными ДНК. Белок образует конъюгат с фрагментом ДНК, содержащим активную группировку в сайте узнавания никазы. Подобраны оптимальные условия проведения аффинной модификации (pH 8, 37ºC, 30 мин). Выход продукта реакции достигает 50%, что подтверждает предположение об участии Cys11 в ДНК-белковых контактах. Установлено, что никаза образует конъюгаты со всеми модифицированными ДНК-субстратами с сопоставимыми выходами независимо от положения реакционной группы относительно сайта узнавания. Это свидетельствует об участии Cys11 в неспецифических взаимодействиях с ДНК. Литература Борисова О.А., Романенков А.С., Метелев В.Г., Кубарева Е.А., Зубин Е.М., Тимченко М.А., Орецкая Т.С. ДНК-дуплексы, содержащие 2'-дезокси-2'-йодацетамидоуридин, как реагенты для аффинной модификации белков // Молекулярная биология. 2003. Т. 37. № 2. С. 1–9. Kachalova G.S., Rogulin E.A., Yunusova A.K., Artyukh R.I., Perevyazova T.A., Matvienko N.I., Zheleznaya L.A., Bartunik H.D. Structural analysis of the heterodimeric type IIS restriction endonuclease R.BspD6I acting as a complex between a monomeric site-specific nickase and a catalytic subunit // J. Mol. Biol. 2008. V. 384. № 2. P. 489–502.