ИСТИНА

Cистема репарации неканонических пар нуклеотидов или «мисматчей» (MMR) существует во всех живых организмах и обеспечивает воспроизведение генетического материала в неизменном виде. Центральную роль в координации различных этапов MMR выполняет белок MutL, который «получает сигнал» об обнаружении «мисматча» от белка MutS и направляет эксцизионную репарацию в дочерней цепи ДНК. В клетках E. coli дочернюю цепь гидролизует сайт-специфическая эндонуклеаза MutH. Полагают, что внесение разрыва в ДНК в большинстве других организмов выполняют гомологи MutL, у которых обнаружен эндонуклеазный мотив. Однако механизм этого процесса практически не исследован. Одним из таких организмов является бактерия Rhodobacter sphaeroides, которая способна выживать в различных стрессовых условиях. Нами впервые выделен белок MutL из R. sphaeroides (rsMutL). Показано, что он обладает эндонуклеазной функцией. Степень рас- щепления ДНК rsMutL увеличивается в ряду Cd2+<Mg2+<Co2+<Mn2+. Продемонстрировано, что АТФ значительно ингибирует способность rsMutL расщеплять ДНК. Исследования взаимодействия MutL с ДНК затруднены из-за динамического характера структуры этого белка, принимающего множество различных конформаций. Нами разработан подход, позволяющий фиксировать MutL на ДНК при взаимодействии тиольной группы остатка Cys этого белка с пиридилдитиогруппой в составе синтетического ДНК-дуплекса. Этот подход был использован для зондирования ДНК-связывающего центра MutL из Е. сoli. Продемонстрировано, что аминокислотные остатки MutL в позициях 218 и 251 наиболее сближены с ДНК-лигандом. Показано, что присутствие белка MutS увеличивает выход и скорость образования конъюгатов мутантных форм MutL с модифицированной ДНК. С использованием метода FRET изучена кинетика образования комплекса MutL с MutS из Е. сoli для разных конформационных состояний белка MutL. Для этого в гомогенном состоянии получены конъюгаты мутантных форм MutS с ДНК. Показано, что «закрытая» форма MutL с высокой скоростью взаимодействует c конъюгатом MutS(N497С)-ДНК. В этом случае дуплекс зафиксирован в ДНК-связывающей области MutS, не участвующей в узнавании «мисматча». Образование комплекса MutS-MutL-ДНК, по-видимому, сопровождается конформационной перестройкой MutL. Работа проводилась при поддержке гранта РФФИ (№ 16-04-00575).