ИСТИНА

Для сохранения целостности и правильности генома и точной передачи генетической информации в клетках всех живых организмов существуют различные системы репарации повреждений ДНК. За исправление повреждений ДНК, возникающих в результате «ошибок» ДНК-полимеразы в процессе репликации, отвечает система репарации некомплементарных пар нуклеотидов или «мисматчей» (MMR). Важнейшим белком системы MMR большинства бактерий и эукариот является MutL, который вносит одноцепочечный разрыв в дочернюю цепь ДНК. Объект нашего исследования – белок MutL из бактерии Neisseria gonorrhoeae (ngMutL), которая является патогеном человека. До сих пор не удалось получить кристаллическую структуру MutL в комплексе с ДНК, поэтому локализация ДНК на различных этапах функционирования MutL является актуальной задачей. Для решения этой задачи хорошо зарекомендовал себя метод «кросслинкинга» моноцистеиновых вариантов белка с ДНК, содержащими пиридилдитиогруппу [1]. Для получения мутантных форм MutL с единственным остатком Cys в зондируемой области на первом этапе необходимо получить бесцистеиновый вариант белка. Совместно с профессором Д.Н. Рао (Индийский институт науки, г. Бангалор) была создана плазмидная конструкция, кодирующая мутантную форму ngMutL, где все остатки Cys заменены на Ser - ngMutLcf. Целью работы являлась сравнительная характеристика АТФазной и эндонуклеазной активностей белка дикого типа (ngMutLwt) и его мутантной формы (ngMutLcf). В данной работе впервые получена мутантная форма белка ngMutLcf, а также оптимизированы методики выделения белка ngMutL. Охарактеризована ДНК-связывающая активность ngMutLwt и показано, что минимальная длина ДНК для эффективного формирования комплексов с белком составляет 30 пар нуклеотидов (п.н.). Продемонстрировано, что мутантный белок ngMutLcf сохраняет способность гидролизовать плазмидную ДНК. Следовательно, два высококонсервативных остатка Cys С-концевого каталитического домена, необходимые для координации ионов металлов, не вовлечены непосредственно в катализ гидролиза ДНК. АТФазная активность белков количественно охарактеризована колориметрическим методом, который основан на измерении концентрации образовавшегося фосфата в присутствии красителя малахитового зеленого. Установлено, что замена всех остатков Cys на Ser не оказывает существенного влияния на основные функции ngMutL. Таким образом, бесцистеиновая форма ngMutL может быть основой для создания мутантных вариантов этого белка с единственным остатком цистеина в заданном положении полипептидной цепи, необходимых для дальнейших исследований. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ (№ 18-74-00049).