ИСТИНА

Большинство известных бактериальных ацилаз являются N-концевыми нуклеофильными гидролазами (Ntn-гидролазы) и выделены в отдельное суперсемейство ферментов, в состав которого входят пенициллинацилаза, глутарилацилаза, N-ацил-гомосеринлактон ацилаза [1]. Данные ферменты используются в промышленности как биокатализаторы для производства антибиотиков, а также играют ключевую роль в образовании биопленок патогенными штаммами микроорганизмов [2]. Несмотря на огромное число уже изученных ферментов, все еще стоит необходимость в поиске новых белков, перспективных для использования в биотехнологии. Гены многих пенициллин ацилаз, глутарил-7-АЦК ацилаз, а также ацил-гомосеринлактон ацилаз из различных микроорганизмов до сих пор не выделены и не изучены. Целью данной работы был поиск генов новых ацилаз в бактериальных штаммах микроорганизмов, способных синтезировать различные ацилазы, которые раннее не были описаны, выделение этих генов, и клонирование в составе плазмиды pET24, обеспечивающей эффективную и стабильную экспрессию этих ферментов в клетках E. coli. На первоначальном этапе работы было проведено типирование полученных микроорганизмов. В ходе биоинформатического анализа геномов Pseudomonas sp. s211 и Achromobacter xylosoxidans были идентифицированы гены pf21 и axy20 соответственно, которые кодируют гипотетические белки пенициллинацилазного типа, принадлежащие к суперсемейству Ntn-гидролаз. Функции генов pf21 и axy20 и соответствующих ферментов раннее не были изучены, что делает их интересными для изучения. В ходе работы для каждого из выбранных генов были сконструированы праймеры для проведения ПЦР с целью клонирования в вектор pET24 по сайтам рестрикции NdeI и XhoI. Затем гены pf21 и axy20 белков пенициллинацилазного типа были клонированы в вектор pET24 с помощью рестрикции, лигирования и трансформации в E. coli Dh5α. На заключительном этапе исследования провели ПЦР-скрининг полученных колоний, выделение плазмид, содержащих гены ферментов пенициллинацилазного типа, секвенирование и сравнительный анализ полученных последовательностей. Литература 1. M. Bokhovea, P. N. Jimenezb, W. J. Quaxb, and B. W. Dijkstra. The quorum-quenching N-acyl homoserine lactone acylase PvdQ is an Ntn-hydrolase with an unusual substrate-binding pocket // PNAS. 2010, V.107, N2, p. 686–691. 2. J. Vogel, Wim J. Quax. Enzymatic Quorum Quenching in Biofilms // Quorum Sensing, Molecular Mechanism and Biotechnological Application, Academic Press. 2019, p. 173-193.