![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
У млекопитающих метилирование цитозиновых остатков в CpG-сайтах ДНК осуществляется ДНК-метилтрансферазой (МТазой) Dnmt3a. Промоторные участки онкогенов, в отличие от соответствующих участков активно транскрибируемых генов, обычно метилированы. В промоторных областях онкогенов находят G-квадруплексные структуры. Как будет функционировать МТаза Dnmt3a при наличии такого отклонения структуры ДНК от классической B-формы, неизвестно. Целью работы явилось изучение одного из этапов реакции метилирования – возможности образования комплексов МТазы Dnmt3a мыши и ее отдельных доменов с олигонуклеотидом, содержащим фрагмент (GGGT)4, который образует внутримолекулярный параллельный G-квадруплекс. Исследовано взаимодействие флуоресцентно меченного олигонуклеотида FAM- (GGGT)4 с полноразмерной МТазой Dnmt3a2, а также с ее каталитическим (Dnmt3a-CD) и регуляторным (PWWP) доменами. PWWP-домен отвечает за взаимодействие Dnmt3a с нуклеосомой за счет узнавания хвоста гистона H3, триметилированного по 36-ому остатку лизина. Рекомбинантные Dnmt3a2, Dnmt3a-CD и PWWP-домен выделены из клеток штамма E. coli, трансформированных плазмидами, несущими соответствующие гены. Методом поляризации флуоресценции установлено, что FAM-(GGGT)4 образует комплексы с Dnmt3a2 и с каждым из ее доменов. При этом Dnmt3a-CD формирует более прочный комплекс с FAM-(GGGT)4, чем PWWP-домен (Kd 120 ± 50 нМ и 950 ± 140 нМ, соответственно). Комплекс Dnmt3a-CD с FAM-(GGGT)4 сравним по прочности с комплексом Dnmt3a-CD и канонической ДНК (Kd 70 ± 20 нМ) и превосходит комплекс Dnmt3a-CD с олигонуклеотидом без G4 (Kd 210 ± 10 нМ). Полученные результаты качественно подтверждены методом торможения в геле. Таким образом, G-квадруплекс в составе ДНК взаимодействует с МТазой Dnmt3a преимущественно за счет каталитического домена фермента. Этот факт позволяет предположить, во-первых, возможное изменение активности фермента из-за его секвестирования на неканонической структуре. Во-вторых, изменение взаимодействия PWWP с хвостом гистона и с нуклеосомой маловероятно (не будет конкуренции за связывание). Интересно, что прокариотическая МТаза M.SssI, имеющая десять общих ключевых мотивов с Dnmt3a-CD, связывает FAM-(GGGT)4 значительно хуже (Kd 490 ± 100 нМ). По-видимому, это связано со способностью Dnmt3a-CD к тетрамеризации, сопровождающейся образованием ДНК-связывающих поверхностей, более специфичных к G-квадруплексным структурам, чем мономерная M.SssI. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-24-0036.
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|---|---|---|---|---|
1. | Lojko_Biologiya_-_nauka_XXI_veka_Puschino_2022.pdf | Lojko_Biologiya_-_nauka_XXI_veka_Puschino_2022.pdf | 687,2 КБ | 22 мая 2022 [LoikoAG] |