ИСТИНА

Из природного штамма Bacillus species нами был выделен и охарактеризован фермент, который узнает на двухцепочечной ДНК специфическую последовательность нуклеотидов –GAGTC , расщепляя только одну из цепей (ту, которая содержит ее сайт узнавания) с образованием 3’OH– конца, спустя четыре нуклеотида после этой последовательности. Одноцепочечную ДНК фермент не расщепляет. При этом BspDI6 проявляет классические свойства рестриктаз – наличие метильной группы в сайте ее узнавания защищает ДНК от гидролиза ее этим ферментом. На основе свойств нашей никазы предлагается новый метод наработки в больших количествах (амплификация) тотальной ДНК-матрицы. Идея метода состоит в том, что если к ДНК в присутствии дезоксирибонуклеотидтрифосфатов прибавить одновременно наш фермент и ДНК-полимеразу, никаза расщепит ДНК только по одной цепи вблизи узнаваемого сайта. После чего, с образовавшегося 3’ОН-конца ДНК-полимераза начнет синтез, вытесняя предшествующую цепь ДНК , используя в качестве матрицы комплиментарную ей цепь. Но с момента начала синтеза новой цепи восстанавливается исходная двухспиральная ДНК, которая заново расщепляется никазой и ДНК-полимераза снова получает возможность для синтеза новой цепи. Идея метода была подтверждена экспериментально на ДНК pUC19 (2700 нуклеотидных пар) с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli. Показано, что при оптимальном соотношении никазы и полимеразы количество вновь синтезированной ДНК в 100 раз превышает количество исходной ДНК-матрицы. Использованный метод может найти применение при наработки ДНК для гибридизации там, где обычно используется реакция ник-трансляции.