ИСТИНА

Биолюминесценция или свечение светляков обусловлена каталитическим окислением D-люциферина кислородом воздуха в присутствии АТФ, ионов магния и фермента люциферазы светляков. Достоинства биолюминесцентных методов - отсутствие фонового сигнала и простота детекции - они не требуют источника возбуждающего излучения. Уникальные аналитические характеристики реакции - высокие квантовый выход и стабильность биолюминесцентного сигнала, селективность реакции по отношению к АТФ, а также быстрота проведения анализа делают люциферин-люциферазную реакцию незаменимой для определения ультрамалых концентраций АТФ и люциферазы. Метод позволяет проводить количественное определение живых клеток (10-1000 клеток в клеточной суспензии в зависимости от их вида), что успешно применяется в микробиологии, биотехнологии, пищевой промышленности, санитарии, медицинской практике и пр. Метод незаменим для выявления и контроля жизнеспособности живых некультивируемых или медленнорастущих микроорганизмов. Разработан и апробирован метод быстрого определения численности живых микобактерий в жидкой и лиофилизованной BCG-вакцине по содержанию внутриклеточного АТФ, что позволило сократить время анализа по сравнению со стандартным методом посевов (28 суток) до 1 ч. На любые стрессовые воздействия живая клетка отвечает изменением содержания АТФ. Тест-системы позволяют в динамике изучать влияние любых стрессовых факторов физической или химической природы на функционирование клетки (жизнеспособность, метаболическую активность, выживаемость, адаптацию, и пр.) и протекание процессов, связанных с синтезом/гидролизом АТФ. Системы эффективны для скрининга и изучения механизма действия лекарственных средств, в частности, антибиотиков, изучения механизмов формирования антибиотикорезистентности. Высокочувствительные биолюминесцентные методы детекции могут использоваться в режиме реального времени без разрушения клеток. Приведены примеры использования тест-систем на основе прокариотических и эукариотических клеток, продуцирующих термостабильную люциферазу светляков с регистрацией АТФ и люциферазы как внутри, так и вне клеток. Использование этих индикаторов позволяет существенно расширить возможности метода и использовать его для изучения проницаемости клеточной мембраны и степени ее повреждения в присутствии мембрано-активных соединений. Так, клетки линии НЕК293, продуцирующие люциферазу, были использованы для изучения кинетики взаимодействия мембраны клеток с дигитонином и его аналогов по высвобождению внутриклеточных компонентов - АТФ и люциферазы, в реакционную среду в режиме реального времени. Кроме того, разработанная тест-система была с успехом использована для изучения механизма действия и выявления необратимых изменений проницаемости клеточных мембран E.coli в присутствии катионных полипептидов полимиксинового ряда. Изучение кинетики внутри- и внеклеточной концентрации АТФ в присутствии колистина показало, что скорость снижения внутриклеточной концентрации АТФ значительно превышала скорость накопления внеклеточного АТФ. Потеря значительной части внутриклеточного АТФ, вероятно, обусловлена снижением активности ферментов дыхательной цепи и АТФ-синтазы, локализованные в цитоплазматической клеточной мембране.