ИСТИНА

Главными участниками системы репарации «мисматчей» (MMR) патогенной бактерии Neisseria gonorrhoeae являются белки MutS (ngMutS), узнающий неканоническую пару оснований, и MutL (ngMutL), который с участием АТФ вносит одноцепочечный разрыв в «дочернюю» цепь ДНК, инициируя удаление «мисматча». Штаммы этой бактерии с делециями генов mutS и mutL спонтанно развивали устойчивость к антибиотикам [1]. ngMutL имеет N-концевой и С-концевой домены. Последний отвечает за эндонуклеазную активность белка. В нем локализованы консервативные металлсвязывающие мотивы, участвующие в координации ионов двухвалентных металлов, из которых наиболее значимыми считаются ионы марганца, магния и цинка. У большинства гомологов MutL из разных организмов ионы марганца или магния непосредственно вовлечены в гидролиз. Ионы Zn2+обычно не активируют эндонуклеазную активность MutL, но в присутствии Mg2+ и Mn2+могут влиять на расщепление ДНК [1]. Металлсвязывающие мотивы ngMutL содержат Cys в консервативных позициях. Замены Cys у большинства гомологов MutL приводят к инактивации системы MMR in vivo, что связывают с потерей цинк-связывающей активности MutL [1]. Целью нашей работы являлось установление влияния замен всех Cys (в том числе консервативных) в белке MutL из N . gonorrhoeae на инициацию репарации «мисматчей». Изучаемый мутантный белок MutL из N . gonorrhoeae (ngMutLcf) имеет замены C171I, C251L, C528A, C604S и C635S. Показано, что Cys белка не являются ключевыми аминокислотными остатками (а.о.) для гидролиза, так как ngMutLcf наряду с белком дикого типа (ngMutLwt) способен вносить разрыв в плазмидную ДНК в присутствии Mg2+ и Mn2+. В присутствии Zn2+ наблюдалось ингибирование эндонуклеазной активности ngMutLwt и ngMutLcf вплоть до полного отсутствия «никованых» форм ДНК. Анализ структур белков с помощью сервиса MIB показал, что Cys белка дикого типа участвуют в координации Zn2+, но функционально заменяются другими а.о. в ngMutLcf [2]. Таким образом, ранее продемонстрированная инактивация MMR in vivo после замены Cys в гомологах MutL не связана с потерей цинк-связывающей способности белка. На линейной ДНК показана эндонуклеазная активность ngMutLwt в комплексе с 𝛽- субъединицей ДНК-полимеразы III (ng𝛽). В условиях, оптимальных для белка дикого типа, ngMutLcf не вносил разрывов в субстрат. Изменение концентрации АТФ или присутствие ионов других металлов не приводило к активации мутантного белка. По-видимому, замены Cys ведут к изменению взаимодействия белков ngMutL и ng𝛽. Это предположение подтверждено результатами моделирования их комплекса. Работа выполнена при поддержке РНФ (проект № 21-14-00161). Источники и литература 1) Монахова М.В., Милакина М.А., Савицкая В.Ю., Романова Е.А., Rao D.N., Кубарева Е.А. «Белок MutL из системы репарации мисматчей бактерии Neisseria gonorrhoeae: взаимодействие с ATP и ДНК». Мол. биол., т. 55, № 2, pp. 289-304, 2021. 2) http://bioinfo.cmu.edu.tw/MIB/ (Metal Ion-Binding site prediction and docking server)