ИСТИНА

Рековерин представляет собой белок с массой 23 кДа, относящийся к суперсемейству EF-hand Ca2+-связывающих белков. Одной из функций рековерина является регулирование активности родопсинокиназы GRK1, регулирующей активность родопсина. При тусклом окружающем освещении уровень кальция в палочковидных клетках сетчатки высок, поэтому рековерин связывается с кальцием, высвобождает миристоиловую группу, прикрепляется к липидному бислою и ингибирует родопсинкиназу. Таким образом, рековерин сохраняет чувствительность родопсина к фотонам, и позволяет глазу обнаруживать визуальные сигналы даже в условиях низкой освещенности. Высвобождение миристоиловой группы при активации значительно изменяет конформацию белка, что позволяет проводить эксперименты с отслеживанием конформации рековерина. Многие биофизические методы ранее использовались для изучения конформационной динамики рековерина, включая ЯМР, поверхностный плазмонный резонанс и флуоресцентную спектроскопию. В данной работе мы описываем флуоресцентные сольватохромные красители, пригодные для спектроскопического наблюдения конформационных изменений в рековерине. Мы изучили четыре красителя на основе хромофорного ядра GFP, которые присоединяются к единственному цистеину в 39-м положении с помощью малеимид-тиоловового взаимодействия. Мы подтвердили связывание красителя с рековерином, проверили специфичность покраски, а затем два из четырех образцов показали изменения в фотофизических свойствах (спектры эмиссии и возбуждения флуоресценции) при добавлении CaCl2 к неактивному и EGTA к активному белку. Один из четырех красителей был успешно использован для отслеживания конформационных изменений GPCR, индуцированных различными лигандами. Наши эксперименты подтвердили сольватохромные свойства исследованных флуоресцентных красителей и показали, что они могут быть успешно использованы для спектроскопического наблюдения конформационной динамики в белках. Работа поддержана Министерством науки в высшего образования РФ (соглашение # 075-00337- 20-03, проект FSMG-2020-0003).