ИСТИНА

Прижизненная визуализация процессов, происходящих в клетках, тканях и в целом организме с высоким разрешением в реальном масштабе времени является одной из фундаментальных проблем молекулярной и клеточной биологии. Существенной вехой в развитии этого направления явилось открытие GFP-подобных флуоресцентных белков и осознание того, что на их базе можно получать белки слияния с белками мишенями, т.е. использовать их в качестве биомаркеров, позволяющих получать информацию о локализации целевых белков и протекании процессов, в которых они участвуют. При создании новых мутантных форм с улучшенными характеристиками одна из задач состояла в создании флуоресцентных белков с наиболее длинноволновым спектром флуоресценции, что позволяло бы уйти от фонового свечения клетки. Однако, даже флуоресцентные белки, имеющие наиболее длинноволновое положение спектров поглощения и флуоресценции, не попадали в спектральную область, отвечающую так называемому «ближне-инфракрасному окну прозрачности», биологических тканей где уже не поглощает гем гемоглобина и меланин, но еще не поглощает вода. Решением этой проблемы может стать использование в качестве флуоресцентных маркеров комплексов бактериальных фитохромов с биливердином. Объектом настоящего исследования стал ближне-инфракрасный флуоресцентный белок iRFP, полученный на основе бактериального фитохрома RpBphP2 из Rhodopseudomonas palustris. Были проанализированы спектральные свойства ближне-инфракрасного белка iRFP в холо- и апоформе и изучены процессы денатурации–ренатурации этих форм белка под действием химического денатуранта гуанидингидрохлорида (GdnHCl). Охарактеризовано связывание iRFP в апоформе с биливердином. Показано, что вторичная и третичная структура белка при связывании биливердина не претерпевает существенных изменений. При этом связывание биливердина приводит к значительному тушению триптофановой флуоресценции iRFP в результате безызлучательного переноса энергии от триптофановых остатков к хромофору белка. Изучение процессов денатурации флуоресцентного белка iRFP в апо- и холоформах под GdnHCl показало, что наличие такой сложной структуры, как узел типа «восьмерка» не препятствует эффективному фолдингу белка, а необратимость денатурации iRFP в холоформе и агрегация молекул белка при ренатурации из полностью развернутого состояния связана со встраиванием хромофора в белковую глобулу. С использованием метода равновесного микродиализа показано, что биливердин взаимодействует с iRFP в апоформе в соотношении 1:1, т.е. достигается полное насыщение белка биливердином, и что конформация и микроокружение хромофора в образующемся комплексе такие же, как в нативном iRFP.