ИСТИНА

Мицелиальные грибы – относительно просто устроенные многоклеточные организмы, легко культивируемые в лабораторных условиях. Их геном, как правило, компактен, имеет небольшие размеры по сравнению с геномами эукариот из других таксономических групп [1]. Такая совокупность признаков делает их удобными объектами для исследования самых разных проблем фундаментального характера и позволяет экстраполировать полученные данные на более сложно устроенные организмы. В настоящее время на переднем крае науки находится область исследований, связанная с моделированием эволюционных процессов в стандартизированных лабораторных условиях – так называемая «лабораторная эволюция», которая представляет собой, по сути, длительную селекцию в заданных условиях [2]. Бурное развитие данного направления связано, прежде всего, с внедрением в науку метода полногеномного секвенирования «следующего поколения» (next-generation sequencing, NGS). Наиболее широко цитируются работы, выполненные на одноклеточных лабораторных организмах – Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae [3, 4]. Мицелиальный гриб Podospora anserina стоит на более высокой ступени организации живого, является многоклеточным организмом, формирует на агаризованной среде видимые невооруженным глазом плодовые тела с аскоспорами, его жизненный цикл детально изучен [5], геном – полностью отсеквенирован и опубликован [6]. Мы впервые использовали P. anserina в качестве модельного объекта для эволюционного эксперимента. Настоящий эксперимент был заложен в 2012 году на кафедре микологии и альгологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова и продолжается по сей день. Непрерывный рост восьми независимых экспериментальных линий P. anserina, произведенных от двух исходных моноспоровых гомокариотических штаммов, поддерживают путем периодических серийных пассажей в условиях погруженного качалочного культивирования. Наша гипотеза [7] об интенсификации накопления у P. anserina генетических изменений в условиях длительного культивирования в жидкой среде полностью подтвердилась. Количество мутаций в таких линиях увеличивается с возрастанием числа пересевов в свежую среду и, соответственно, с увеличением числа клеточных делений – подобно тому, как это имело место в классических экспериментах, поставленных на E. coli [8]. Наиболее удаленная от старта эксперимента временная точка, в которой было выполнено полное прочтение ДНК всех линий P. anserina, составляет 268 пассажей (немногим более 4-х лет). К указанному моменту времени суммарное число однонуклеотидных мутаций (высокочастотных однонуклеотидных полиморфизмов), закрепившихся в восьми линиях, достигло 129. Среди них было выявлено 52 миссенс-мутации (в результате таких мутаций измененный кодон начинает кодировать другую аминокислоту) и 8 нонсенс-мутаций (приводят к появлению стоп-кодона в кодирующей области). Названные две группы мутаций вызывают большой интерес для анализа, так как могут оказывать непосредственное влияние на белки, кодируемые соответствующими генами, а следовательно, и на фенотипические признаки изучаемого организма. Более того, количество обнаруженных у P. anserina нонсенс- и миссенс-мутаций значительно превышает ожидаемое, что может указывать на их адаптивный характер. Следует отметить, что накопление внешних фенотипических изменений у выбранного нами гриба протекает в условиях эксперимента достаточно быстро и затрагивает несколько параметров. Через 3-4 месяца роста в жидкой питательной среде в режиме пересевов на каждые 2-е или 3-и сутки все независимо поддерживаемые линии P. anserina теряют свойственную им темную пигментацию, перестают формировать микроконидии, в обилии продуцируемые в погруженных условиях на ранних этапах эксперимента, но заметно увеличивают выход мицелиальной биомассы. Изоляты, получаемые как высев образцов мицелия из экспериментальных погруженных культур на агаризованную среду того же состава, демонстрируют иную структуру воздушного мицелия в сравнении с диким типом, растущим на плотной среде, не формируют плодовые тела и функциональные микроконидии, которые у изучаемого вида служат для оплодотворения, – иными словами, происходит утрата фертильности. Однако скорость роста изолятов, полученных как на начальных этапах, так и из линий, несколько лет проведших в жидкой среде (данные за 4,5 года лабораторной эволюции), остается порядка 5-7 мм/сут, что сопоставимо с диким типом. Таким образом, дезадаптации к вегетативному росту в поверхностных условиях до сих пор отмечено не было. Интересно также, что изоляты так же активно, как и штаммы дикого типа, оккупируют агаризованную среду, приготовленную на основе навоза травоядных животных (в нашем случае – навоза козы), который является природным субстратом P. anserina. Было проведено попарное скрещивание изолятов, обладающих противоположными типами спаривания: 3 линии, которые являются производными штамма S (имеет тип спаривания «–»), и пять линий – производных штамма s (имеет тип спаривания «+»), – при попарном скрещивании дают 15 возможных вариантов. На способность скрещиваться между собой были протестированы изоляты P. anserina, соответствующие трем временным точкам – 1,5 мес. (пассаж № 15), 4 мес. (пассаж № 43) и 4 года 5 мес. (пассаж № 277) от момента запуска эксперимента. Практически ни в одном из вариантов формирования плодовых тел отмечено не было, в то время как исходные штаммы s(+) и S(–) при совместном посеве на чашку Петри с агаризованной средой образуют плодовые тела с аскоспорами. Лишь одна из экспериментальных линий, взятая в первой временной точке, сформировала плодовые тела при скрещивании с линиями противоположного типа спаривания, также взятыми в первой временной точке; однако эти плодовые тела не отстреляли аскоспоры, как это происходит у диких вариантов. Таким образом, хотя и с разной скоростью, мицелий P. anserina становится стерильным в условиях лабораторной эволюции. Продолжительное инкубирование изолятов на козьем навозе не стимулировало образования у них плодовых тел при попарном скрещивании (культивирование на природном субстрате нередко используют для восстановления ряда свойств микроорганизмов, длительное время поддерживаемых на искусственных средах). Полученные нами изоляты стабильны по своим морфологическим и физиологическим свойствам. Перечисленные морфофизиологические изменения P. anserina характерны, необратимы и воспроизводимы при повторении опыта (результаты первого пускового долгосрочного эксперимента опубликованы [7]). При этом они не являются случайными, а явно направлены на «переключение» экспериментальной культуры к развитию лишь в форме вегетативного мицелия и блокировке половой функции. Вероятно, такую стратегию можно считать адаптивной для роста гриба в «идеальных» условиях, которые предоставляют все необходимые питательные вещества в легко доступной форме, постоянную температуру, исключают пересыхание питательного субстрата и т.д. Следует полагать, что доступность питательных веществ в постоянно перемешиваемой жидкой среде выше для грибного мицелия, чем в случае его культивирования на агаризованной среде того же состава. С другой стороны, для копротрофного гриба P. anserina, как и для любого другого гриба, развивающегося в природе в наземных условиях, длительный рост в интенсивно аэрируемой жидкой среде может требовать перехода в особый метаболический статус, а значит, возникает необходимость в адаптации. Следует полагать, что наблюдаемая непосредственно адаптивная изменчивость P. anserina носит преимущественно негенетический характер: отсеквенированные после первых 6 месяцев проведения опыта (пассаж № 64) три мицелиальные линии в сумме несли всего 10 мутаций, не повторяющихся в параллельных линиях. Поэтому вклад факторов, не связанных с изменениями ДНК, в фенотипические изменения P. anserina невозможно исключать, и он может быть очень значительным. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 16-04-01845а. Список литературы 1. Дьяков Ю.Т., Шнырева А.В., Сергеев А.Ю. Введение в генетику грибов: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений – М.: Издетельский центр «Академия», 2005. – 304 с. 2. Dragosits M., Mattanovich D. Adaptive laboratory evolution – principles and applications for biotechnology // Microbial Cell Factories. 2013. 12:64. http://www.microbialcellfactories.com/content/12/1/64 3. Crozat E., Winkworth C., Gaffé J. et al. Parallel genetic and phenotypic evolution of DNA superhelicity in experimental populations of Escherichia coli // Mol. Biol. Evol. 2010. 27:2113–2128. 4. Kryazhimskiy S., Rice D.P., Jerison E.R., Desai M.M. Global epistasis makes adaptation predictable despite sequence-level stochasticity // Science. 2014. 344(6191):1519-1522. 5. Osiewacz H.D. Aging and mitochondrial dysfunction in the filamentous fungus Podospora anserina // In: Nyström T. and Osiewacz H.D. (Eds.), Model Systems in Aging. Topics in Current Genetics. 2003. Vol. 3 – Springer-Verlag Berlin Heidelberg, – p. 17-38. 6. Espagne E., Lespinet O., Malagnac F. et al. The genome sequence of the model ascomycete fungus Podospora anserina // Genome Biology. 2008. Vol. 9. № 5, p. 1-22. 7. Кудрявцева, О.А., Мажейка, И.С., Соловченко, А.Е., Камзолкина, О.В. Генетическая нестабильность короткоживущего аскомицетного гриба Podospora anserina, индуцируемая в процессе продолжительного глубинного культивирования // Микробиология. 2011. 80(6):772–786. 8. Barrick J.E., Yu D.S., Yoon S.H. et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli // Nature. 2009. 461, 1243-1247.