ИСТИНА

Разобщители окислительного фосфорилирования «рассеивают» протонный градиент на внутренней мембране митохондрий, транспортируя протоны обратно в митохондрии минуя АТФ-синтетазу и приводя тем самым к разобщению окисления и фосфорилирования в митохондриях. Умеренная степень разобщения может быть полезна в терапевтических целях. На основе разобщителей могут быть созданы лекарства против ожирения и болезней, связанных с окислительным стрессом, включая нейродегенеративные заболевания. Однако многие известные в настоящее время протонофоры являются высокотоксичными веществами. Необходим поиск новых митохондриальных разобщителей, которые имеют большое окно между разобщающими и токсичными концентрациями. В связи с этим, тесты на токсичность являются ключевыми в вопросе практического применения протонофоров. В качестве тестовой системы для изучения токсичности митохондриальных разобщителей мы разработали и используем изолированную нервную систему моллюска. Преимущества этой тестовой системы: 1) Нейроны находятся в естественной среде, окружены глиальными клетками и нервными оболочками. 2) Ганглии, помещенные в солевой раствор, сохраняют функции. Например, изолированные педальные ганглии продолжают генерировать двигательный ритм, и влияние сенсорных входов незначительно. 3) В ганглиях моллюсков есть крупные нейроны, которые можно идентифицировать в различных препаратах. Это позволяет исследовать свойства индивидуальных нейронов в большом количестве разных экспериментов. 4) Нейроны моллюсков имеют весь основной набор рецепторов и ионных каналов, характерных для млекопитающих. Эксперименты проводили на нейронах изолированных ганглиев прудовика (Lymnaea stagnalis). Ганглии вырезали и раскалывали на дне ванночки, заполненной солевым раствором. Мы выделили и исследовали показатели нейронной активности, изменения которых были универсальными для всех изученных нами разобщителей. Добавление разобщителя в омывающий раствор вызывает деполяризацию нейрона, увеличение частоты спайковой активности и уменьшение амплитуды спайков. Уменьшается скорость деполяризации и реполяризации мембраны во время генерации спайка, что приводит к его расширению. Со временем клетка совсем прекращает генерировать спайки. В предлагаемой системе мы исследовали как классические митохондриальные разобщители, такие как CCCP, FCCP и DNP, так и новые разобщители, синтезированные в нашем институте. Разобщители отличаются по эффективной концентрации и по времени развития эффекта. Более слабое влияние на мембранный потенциал и спайковую активность нейрона соответствует меньшей токсичности разобщителя. Классические протонофоры CCCP и FCCP в концентрации 2 – 10 мкМ изменяли спайковую активность нейронов через 2 – 10 минут. Полное прекращение спайковой активности наблюдалось через 20 – 40 минут. В отличие от них DNP, который длительное время использовали как лекарство от ожирения, влиял на спайковую активность в концентрации 200 – 500 мкМ. Вновь синтезированный в нашем институте митохондриальный разобщитель протонофорного типа митофлуоресцеин (mitoFluo) представляет собой конъюгат флуоресцеина с децил(трифенил)фосфонием [1,2]. Качественно влияние mitoFluo подобно действию СССР, но проявляется при больших концентрациях (10 – 20 мкМ) и при гораздо более длительном воздействии (2 – 2,5 часа). Другой вновь синтезированный протонофорный разобщитель CMTPP-C10 является сложным эфиром карбоксиметилтрифенилфосфония [3]. В концентрации 10 – 20 мкМ CMTPP-C10 действует на нейроны гораздо мягче и медленнее, чем СССР. В течение часа после добавления CMTPP-C10 активность нейронов возвращается к норме. Еще одна новая группа разобщителей, производные 7-гидроксикумарина, UB-3-COOCn, проявляли протонофорные свойства, присущие другим митохондриальным разобщителям в экспериментах на липосомах и изолированных митохондриях, но при этом они почти не влияли на активность нейронов [4]. Около 10 лет назад был синтезирован протонофор ВАМ15 – производное оксадиазолопиразина. В первой статье утверждалось, что он не действует на плазматическую мембрану клеток, и поэтому не токсичен [5]. Сейчас ВАМ15 планируют использовать как лекарство в борьбе с ожирением и инсулинорезистентностью, и как геропротектор. В нашей тестовой системе мы показали, что ВАМ15 в микромолярных концентрациях (5 мкМ) вызывает такое же необратимое подавление электрической активности нейронов, как и СССР, но реакция развивается медленнее, примерно в течение часа. Следовательно, ВАМ15 токсичен даже в низких концентрациях [6]. Также мы исследовали протонофорную активность широко используемого в быту антимикробного препарата триклозана [7]. В нашей тестовой системе триклозан и СССР оказывают похожее действие на активность нейронов. Но влияние триклозана обнаруживается при более длительном воздействии (40-60 мин.) и требует больших концентраций (10-20 мкМ), что соответствует различию в разобщающей активности триклозана и СССР на митохондриях. Изменения в активности нейронов мы связываем с изменением концентрации ионов Са2+ в цитоплазме, так как протонофорные разобщители индуцируют выход кальция из митохондрий, а работа основных нейронных каналов регулируется изменениями внутриклеточной концентрации ионов кальция. Тот факт, что вновь синтезированные протонофорные разобщители оказывали слабое токсическое действие на нейроны, возможно, объясняется тем, что они подвергаются воздействию клеточных ферментов. Например, нами показано, что производные 7-гидроксикумарина UB-3-COOCn гидролизуются митохондриальной альдегиддегидрогеназой (ALDH2) [4]. Сокращения: CCCP – карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон; FCCP - карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразон; DNP – 2,4-динитрофенол; UB-3-COOCn – алкиловые эфиры умбеллиферон-3-карбоновой кислоты. Список литературы: 1. doi: 10.1039/c4cc04996a; 2. doi: 10.1134/S0006297919100043; 3. doi: 10.1016/j.abb.2022.109366; 4. doi: 10.1016/j.bioelechem.2023.108369; 5. doi: 10.1016/j.molmet.2013.11.005; 6. doi: 10.1016/j.bioelechem.2020.107673; 7. doi: 10.1016/j.bbamem.2018.01.008