ИСТИНА

Фермент простагландин-H-синтаза (PGHS; К.Ф.1.14.99.1) катализирует превращение арахидоновой кислоты в простагландин H2 (PGH2) в два этапа: циклооксигеназная реакция, в ходе которой арахидоновая кислота, соединяясь с двумя молекулами кислорода, превращается в простагландин G2 (PGG2), и пероксидазная реакция, в результате которой PGG2 преобразуется в PGH2 в присутствии донора электронов. PGHS играет решающую роль в синтезе простагландинов, которые ответственны за важные физиологические процессы: реакции свёртывания крови и иммунного ответа, репродуктивные функции. Фермент необратимо инактивируется в ходе катализируемых им реакций. Инактивация имеет первый порядок по концентрации фермента. Из интегральной кинетической кривой накопления продукта можно определить константу инактивации и предельный выход продукта, значения которых зависят от условий протекания реакции. Для осуществления обеих катализируемых реакций строго необходимо наличие кофактора – гемина (производного от протопорфирина IX). Ранее вопрос их взаимодействия не был достаточно изучен. Целью данной работы являлось исследование кинетического механизма взаимодействия фермента с гемином, в том числе определение зависимости кинетических параметров от условий протекания реакции, а также влияния гемина на инактивацию фермента. Для анализа системы PGHS-гемин была использована равновесная модель. На основании этой модели исследовали взаимодействие апофермента с кофактором. По результатам варьирования концентрации гемина в диапазоне 0-2000 нМ и измерения циклооксигеназной активности была определена равновесная константа диссоциации комплекса фермент-гемин (47±6 нМ). Предельное количество продукта реакции достигалось при концентрации гемина ниже равновесной константы, т.е. в той области концентраций кофактора, где соотношение между апо- и холоформой сдвинуто в сторону апоформы. Предположительно, это объясняется смещением равновесия в сторону образования холоформы в результате инактивации фермента в ходе реакции. Это приводит к тому, что при увеличении концентрации гемина количество продукта растёт быстрее, чем начальная скорость реакции. Кинетика взаимодействия PGHS и гемина существенным образом зависит от концентрации детергента (твина-20) в реакционной среде (он используется в ходе выделения фермента для его солюбилизации из мембран). С увеличением его концентрации уменьшается константа образования холофермента, и, таким образом, увеличивается равновесная константа диссоциации. Взаимодействие PGHS и гемина, измеряемое по пероксидазной реакции, зависит от донора электронов (субстрата). Так, для реакции с адреналином равновесная константа диссоциации выше, чем для реакции с N,N,N’,N’-тетраметил-n-фенилендиамином (TMPD).