ИСТИНА

Оригинальная методология yosshi, разработанная сотрудниками отдела биокинетики НИИФХБ им. А. Н. Белозерского для структурно опосредованного поиска природных дисульфидных мостиков в белковых суперсемействах [1] хорошо предсказывает уже описанные в литературе дисульфидные мостики, способствующие увеличению термостабильности. В данной работе мы изучили возможности и ограничения сервиса yosshi на примере стабилизации пенициллинацилазы (ПА) E.coli. Для этой цели мы использовали всю совокупность известных на данный момент белковых последовательностей суперсемейства Ntn-гидролаз (628 последовательностей), структурно соответствующих ПА E.coli, с тем чтобы найти новые точки для введения дисульфидных мостиков в её структуру. Было обнаружено 235 дисульфидных мостиков, которые можно было бы включить в состав ПА E.coli. Однако структурный фильтр, применяемый на 3-м этапе алгоритма yosshi, сократил это число до 11. Наиболее высокий приоритет, определяемый по встречаемости в природе, получил ранее неизвестный S-S мостик в позиции β307-β320. Второй и третий приоритет yosshi отдает мостикам β500-β533, встречающемуся у термостабильной ПА A.faecalis, и β150-β173, встречающемуся у солевых экстремофилов. При экспериментальной проверке было показано, что мутация №1 bT307С+bV320С не оказывает влияния на каталитическую активность и термостабильность ПА E.coli, что связано с обнаруженным нарушением формирования дисульфидного мостика, о чем свидетельствует чувствительность препарата фермента к реактиву Эллмана. Отсутствие или замедленная кинетика образования S-S мостика может быть связана с увеличенным расстоянием между цистеинами. Хотя расстояния между Cα и Cβ – 7.4 Å и 4.6 Å статистически возможны (3σ), кинетика образования мостика может быть низкой. Тем более, что в ближайшем микроокружении нового мостика находится электрофильный βR317. Мутация №2 βW500C+βR533C не оказывает существенного влияния на каталитическую активность ПА, но приводит к снижению термостабильности по сравнению с природным ферментом в 2 раза. Вероятно, снижение стабильности вызвано потерей электростатического взаимодействия βR533 с остатком βD280 на соседней альфа-спирали. Мутантная форма №3 βS150C+βN173C экспериментально не получена, поскольку визуальный анализ указал на возможную потерю 9 нековалентных взаимодействий, которые не может компенсировать одна ковалентная S-S связь, что было подтверждено сравнительной молекулярной динамикой природного фермента и мутантной формы. Таким образом, для предсказания стабилизирующих дисульфидных мостиков с помощью веб-сервера yosshi требуется применение более жесткого геометрического критерия, дополнительная оценка негативного влияния нового микроокружения S-S связи, а также учет исчезающих нековалентных взаимодействий. Литература 1.https://biokinet.belozersky.msu.ru/yosshi