ИСТИНА

Перспективным направлением создания новых лекарственных форм является модификация существующих классов антибиотиков с использованием альтернативных противомикробных препаратов, например, на основе ионов серебра. Такие препараты потенциально могут повышать активность обычных антибиотиков: восстанавливать чувствительность бактерий к лекарственному средству, увеличивать проницаемость внешней и внутренней мембран, приводя к возрастанию притока антибиотика в клетку. В данной работе был использован препарат на основе гентамицина и наночастиц серебра, полученного с помощью низкотемпературного соосаждения. Для изучения эффективности действия лекарственных композиций использовали биолюминесцентная тест-система на основе живых клеток E.coli, продуцирующих люциферазу светляков. Эта позволяет в реальном времени дифференцировать следующие параметры: внутри- и внеклеточную люциферазную активность, а также изменение содержания АТР в клетках. Для измерения внутриклеточной люциферазы использовали субстратную смесь на основе люциферина с рН5.0, для измерения внеклеточной активности - рН7.8, при таких условиях люциферин не проникает в клетку. Содержание АТР в лизированных ДМСО (для определения общего содержания АТР) и цельных клетках (для определения внеклеточного АТР) определяли с помощью АТР-реагента. Концентрацию внутриклеточного АТР вычисляли по разности общего и внеклеточного АТР. Интенсивность биолюминесценции регистрировали на люминометре Zulux Corp. (США). Исследование проводилось на живых клетках E. coli, экспрессирующих термостабильную люцифреазу светляков L. mingrelica. Достоинства метода - абсолютная специфичность фермента к АТР и люциферину, высокий квантовый выход, линейная зависимость между интенсивностью испускаемого света и концентрацией АТР, а также легкость регистрации сигнала. Продемонстрированы возможности метода для изучения механизма действия антибактериальных препаратов. Совместное действие гентамицина и ионов серебра изучали в широком диапазоне концентраций агентов для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК), концентрацию клеток варьировали от 10 до 300 млн кл/мл. Реакционную смесь инкубировали в среде LB в течение нескольких часов при температуре 37оС и интенсивном перемешивании. В присутствии гентамицина наблюдалось плавное торможение роста клеток по сравнению с контролем, увеличение содержания внеклеточного АТР и остановка синтеза внутриклеточной люциферазы. Скорость гибели клеток зависела от концентрации препарата. В качестве контроля использовали метод посевов на агаризованную среду LB. Таким образом, биолюминесцентная тест-система может использоваться для скрининга новых лекарственных форм известных и новых антибактериальных препаратов. Работа выполнена в рамках госзадания МГУ им. М.В. Ломоносова – номер ЦИТИС 121041500039