ИСТИНА

Исследование экзосом и микровезикул в последние годы привлекает к себе большой интерес научного сообщества в связи с их ролью в межклеточной коммуникации, а также потенциального применения в качестве носителей маркеров различных заболеваний и терапевтических агентов. Дифференциальное центрифугирование остается одним из наиболее широко используемых методов изоляции экзосом/микровезикул, несмотря на то, что метод весьма трудоемкий и в большинстве случаев требует большого количества стартового материала, сопровождается существенными потерями и не обеспечивает гомогенности популяции изолированных микровезикул. Цель работы заключалась в анализе популяции частиц, седиментированных на каждом этапе дифференциального центрифугирования, и разработке возможных подходов, позволяющих изолировать более чистую фракцию экзосом с наименьшими потерями. Мы анализировали размер, форму и концентрацию частиц, седиментированных при центрифугировании супернатанта клеточной культуры HТ29 при 500 g, 1000 g, 10тыс.g и 100тыс.g. Для оценки размера и измерения концентрации частиц использовался прибор NanoSight (NanoSight Ltd, Великобритания). Морфология частиц анализировалась с использованием методов электронной и атомной силовой микроскопии. Было продемонстрировано, что существенная часть сферических частиц размером 80-100 нм седиментируется уже при 10тыс.g. Чтобы подтвердить, что экзосомы действительно могут быть частично седиментированы на данном этапе протокола дифференциального центрифугирования, очищенные по стандартному протоколу экзосомы (5 минут в 500xg, 10 минут в 1тыс.g, 30 минут в 10тыс.g и 2х60 минут в 100тыс.g) были подвергнуты центрифугированию при 10тыс.g в течение 30 минут. Анализ осадка и супернатанта и показал присутствие идентичных частиц. Мы обсуждаем подходы, позволяющие устранить этап центрифугирования при 10тыс.g, существенно увеличив тем самым эффективность изоляции и чистоту популяции экзосом.