ИСТИНА

Обнаружение нуклеиновых кислот представляет большой интерес как для фундаментальных, так и прикладных биохимических и медицинских исследований. Известно, что все азотистые основания, входящие в состав дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК), обладают электроактивностью, однако прямой электрохимический подход к обнаружению ДНК затруднен расположением азотистых оснований внутри двойной спирали. Токи окисления ДНК также снижаются с увеличением длины биополимера. M. Hocek и M. Fojta была предложена стратегия электрохимического определения нуклеиновых кислот путем ферментативного включения в полимерную цепь нуклеотидов, модифицированных электроактивными фрагментами. Данной научной группой также разработан подход к «мультипотенциальному редокс кодированию» ДНК, когда каждый нуклеотид помечен своей электроактивной меткой [1]. Идя по этому пути, мы представляем палитру новых синтетических нуклеотидов, 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатов (дУТФ) с остатками тирозина (дУТФ-Тир), триптофана (дУТФ-Трп) [2, 3] или 4-нитротолуола (дУТФ-Нитро), присоединенными в положение C5 пиримидинового кольца через различные линкеры. Исследуемые нуклеотиды были протестированы в качестве носителей электроактивных групп, а также подходящих субстратов для полимераз, используемых в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и изотермической рекомбиназной полимеразной амплификации (РПА), с целью электрохимического обнаружения продуктов амплификации – двунитевых ДНК (днДНК) ампликонов. В работе были изучены механизмы окисления и восстановления как свободных соединений-меток, так и их коньюгатов с дУТФ с помощью циклической и квадратно-волновой вольтамперометрии на печатных графитовых электродах. При восстановлении производных дУТФ-Нитро наблюдали появление четких пиков при потенциале от –0.7 до –0.9 В аналогично n-нитротолуолу и 3-нитротирозину. Сигнал восстановления дУТФ-Нитро был пропорционален концентрации вещества в микромолярном диапазоне. В свою очередь, производные дУТФ-Тир и дУТФ-Трп продемонстрировали четко выраженные пики окисления при 0.5–0.7 В аналогично соответствующим свободным аминокислотам, тирозину и триптофану [2]. Сигналы окисления дУТФ-Тир и дУТФ-Трп были чувствительны к концентрации модифицированных нуклеотидов. Нуклеотиды дУТФ-Тир, дУТФ-Трп и дУТФ-Нитро были успешно включены в различные ПЦР- или РПА-генерируемые ампликоны днДНК длиной 1–2 сотни пар оснований (при 80–100% замене природного дТТФ в реакционной смеси). Модифицированные нуклеотиды и соответствующие продукты амплификации были обнаружены методом квадратно-волновой вольтамперометрии в микромолярных и суб-микромолярных концентрациях за счет электроактивной метки. Фрагменты днДНК с модифицированными нуклеотидами дали характерные сигналы окисления/восстановления, в то время как для немодифицированной днДНК в тех же условиях пиков получено не было. Кроме того, было зарегистрировано влияние структуры линкера электроактивной группы на электрохимическое поведение модифицированного нуклеотида. Управляемое полимеразой включение искусственных нуклеотидов в ПЦР и РПА показало, что эффективность процесса может зависеть от молекулярной структуры электроактивного фрагмента, включая структуру линкера, а также от заданной последовательности ампликона. С увеличением доли модифицированных нуклеотидов в смеси, выход полимеразной реакции снижался. Таким образом, разработан способ электрохимического анализа биологических образцов на присутствие ДНК искомого патогена на печатных графитовых электродах, пригодных для анализа по месту требования. Протестированные производные дУТФ хорошо дополняют существующую библиотеку меченых электроактивными группами нуклеотидов, применяемых в электроанализе нуклеиновых кислот [1]. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 19-14-00247, https://rscf.ru/project/19-14-00247/. Литература 1. Hocek, M.; Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection // Chem. Soc. Rev. 2011. vol. 40, p. 5802–5814. 2. Suprun, E.V.; Khmeleva, S.A.; Kutdusova, G.R.; Duskaev, I.F.; Kuznetsova, V.E.; Lapa, S.A.; Chudinov, A.V.; Radko, S.P. Deoxyuridine triphosphates modified with tyrosine or tryptophan aromatic groups for direct electrochemical detection of double-stranded DNA // Electrochim. Acta. 2020. vol. 362, № 137105. 3. Suprun, E.V.; Khmeleva, S.A.; Kutdusova, G.R.; Ptitsyn, K.G.; Kuznetsova, V.E.; Lapa, S.A.; Chudinov, A.V.; Radko, S.P. Deoxyuridine triphosphates modified with tyrosine aromatic groups for direct electrochemical detection of double-stranded DNA products of isothermal recombinase polymerase amplification // Electrochem. Commun. 2021. vol. 131, № 107120.