ИСТИНА

Помутнение роговицы вызывает не менее 5% от всех случаев слепоты в мире. Основным консервативным методом лечения является нанесение кортикостероидов и митомицина С, применение которых ограничено в случае инфекционных поражений и может иметь долгосрочные побочные эффекты в виде катаракты и глаукомы. Основные клинически неблагоприятные последствия повреждения роговицы – образование бельма и неоваскуляризация, происходящие в строме роговицы. При этом эндогенная способность стромы роговицы к регенерации остается дискуссионным вопросом. Если регенеративные механизмы действительно присутствуют в роговице, то их стимуляция может стать новым методом лечения, дополняя существующие современные подходы. Целью данной работы было разработать модели регенерирующего и нерегенерирующего щелочного ожога роговицы у мыши и сравнить основные изменения тканей при двух указанных типах ответов. Щелочные ожоги роговицы были индуцированы путем нанесения круглых фрагментов фильтровальной бумаги радиусом 2 мм, смоченных растворами NaOH концентрации 0,25M, 0,5М и 1,0М. Все мыши были разделены на 3 группы по времени вывода из эксперимента (3 часа, 7 дней и 21 день). Непосредственно перед выводом проводилась стереомикроскопия для оценки прозрачности роговицы. Далее мы выполняли иммуногистохимическое мечение цельных роговиц на αSMA (все временные точки), а также на маркеры кровеносных (CD31) и лимфатических (LYVE1) сосудов (7 и 21 день после повреждения). Данные были получены методом конфокальной микроскопии с последующей объемной морфометрией в программе FIJI. После прижизненной оценки прозрачности роговицы мы обнаружили, что нанесение щелочи в концентрации 1,0М приводило к появлению бельма у всех животных, тогда как роговицы после нанесения концентрации 0,5М и ниже всегда были визуально прозрачны, т.е. регенерировали. При этом изначальные объем и глубина повреждения были очень выраженными: даже в концентрации 0,25М NaOH вызывал выраженный некроз по всей толще роговицы. Для изучения процессов, протекающих в роговице после повреждения, мы сравнивали регенерирующий ответ тканей после нанесения 0,5M NaOH и нерегенерирующий после нанесения 1,0M NaOH. Мы обнаружили, что на 7 день после повреждения и регенерирующий и нерегенерирующий ответы проходили через стадию увеличения общего числа клеток и появления αSMA-положительных миофибробластов, при этом часть этих клеток и миофибробластов исчезала к 21 дню. Однако исчезновение большой части миофибробластов после нерегенерирующего повреждения не приводило к восстановлению прозрачности, что, по-видимому, связано с оставшимся после них дезорганизованным внеклеточным матриксом. Эндотелий роговицы восстанавливался к 21 дню после регенерирующего повреждения, тогда как после нерегенерирующего на его месте в зоне повреждения формировались αSMA-положительные кластеры клеток, которые указывают на протекание эндотелиально-мезенхимального перехода, возможность которого описана в литературе. Важно отметить, что на 7 день после регенерирующего повреждения αSMA-положительный эндотелий также наблюдался, что не препятствовало его дальнейшему восстановлению. Неоваскуляризация наблюдалась только после нерегенерирующего повреждения, причем кровеносные сосуды были зрелые уже на 7 день, на что указывало их иммунофлуоресцентное мечение на αSMA. Общий объем и протяженность сосудов не менялись от 7 до 21 дня после повреждения. Таким образом, мы обнаружили что в роговице реализуется 2 принципиально разные программы ответа на повреждение: регенерирующая, при которой несмотря на временное формирование миофибробластов поддерживается организованное прозрачное состояние внеклеточного матрикса стромы, происходит восстановление нормального эндотелия и отсутствует неоваскуляризация, а также нерегенерирующая, при которой происходит устойчивое изменение структуры стромы, формироввание кластеров αSMA-положительных клеток вместо нормального эндотелия, а также прорастание кровеносных и лимфатических сосудов. Разработанная в данной работе модель позволяет сравнивать регенерирующие и нерегенерирующие программы ответа роговицы на повреждение, что в перспективе позволит разработать методы молекулярной или клеточной терапии, направленные на запуск регенерирующего ответа при нерегенерирующем повреждении. Работа выполнена в рамках государственного задания МГУ имени М.В. Ломоносова и по перспективному направлению научно-образовательного развития Московского университета «Молекулярные технологии живых систем и синтетическая биология».