ИСТИНА

Множество процессов, связанных с жизнедеятельностью нейронов и их функциональной активностью, регулируются сигналами ионов кальция. Разнообразие ответов на эти сигналы обеспечивается за счет действия нейрональных кальциевых сенсоров (НКС) – семейства внутриклеточных Са2+-связывающих белков, высокоспецифичных для нервной ткани. Белки семейства НКС обладают сходством структурной организации и нередко колокализуются в нейронах одного и того же типа. При этом регуляторное действие каждого из НКС характеризуется специфичностью в отношении определенных сигнальных партнеров, среди которых различные рецепторы, эффекторные ферменты, а также ряд других белков. Примером сигнальной системы, Са2+-зависимая регуляция которой осуществляется белками НКС, является передача светового сигнала в фоторецепторных клетках сетчатки глаза. Так, внутренние сегменты и синаптические окончания палочек сетчатки содержат НКС рековерин и белки активаторы гуанилатцикалзы, которые являются специфичными для данного типа клеток и обладают способностью регулировать строго определенные мишени в рамках каскада фототрансдукции. В то же время, в фоторецепторах обнаружен еще один НКС, NCS1, являющийся родоначальником семейства и широко распространенный в клетках центральной нервной системы. Функция NCS1 в фоторецепторных клетках сетчатки до недавнего времени оставалась неустановленной. С учетом этих обстоятельств основной целью настоящей работы является поиск мишеней NCS1 в фоторецепторной клетке, а также исследование механизма регуляторной активности фоторецепторного NCS1 с учетом его совместной локализации с другими белками семейства. В результате проведенных исследований получены следующие результаты. На основе тотальной РНК из препарата мозга Bos taurus получена кДНК, соответствующая ранее охарактеризованному гену NCS1. Впервые обнаружена дополнительная природная мРНК, соответствующая мутантной форме NCS1, которая содержит замену остатка лизина-9 на остаток глутаминовой кислоты. Проведено клонирование обоих вариантов гена NCS1 в экспрессионный вектор для получения суперпродуцентов белка в клетках Escherichia coli. С помощью совместной экспрессии полученных генов с геном N-миристоилтрансферазы 1 Saccharomyces cerevisiae и последующей хроматографической очистки получены гомогенные препараты NCS1 дикого типа и его мутанта K9E. Методом аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии показано, что полученные препараты содержат преимущественно миристоилированную форму NCS1, т.е. соответствуют природному аналогу. Охарактеризованы термостабильность, а также спектр собственной флуоресценции полученных белков. Показано, что исследуемые формы NCS1 способны взаимодействовать с мембранами фоторецепторной клетки, причем мутация K9E усиливает Ca2+-зависимость этого взаимодействия. На основании структурного анализа высказано предположение, что одной из мишеней NCS1 в фоторецепторной клетке может являться родопсинкиназа – эффекторный фермент, отвечающий за десенситизацию зрительного рецептора родопсина. Методом аффинного соосаждения NCS1 дикого типа с фрагментами, соответствующими различным участкам родопсинкиназы, показано, что NCS1 способен взаимодействовать с последовательностью 1MDFGSLETVVANSAFIAARGSFDAS25 фермента. Установлено, что NCS1 обладает несколько меньшим сродством к указанному участку родопсинкиназы по сравнению с НКС рековерином, являющимся доказанным природным модулятором фермента. Работа поддержана за счет средств гранта РФФИ № 12-04-01045-а, рук. Зерний Е.Ю.