ИСТИНА

Цель: Изучить профиль метилирования ДНК c помощью полногеномного бисульфитного секвенирования (WGBS) в 8 образцах сперматозоидов в зависимости от перипубертатной экспозиции диоксинами, химическими веществами с известными свойствами нарушать работу эндокринной системы (endocrine disrupting chemicals), в проспективной когорте мальчиков-молодых мужчин, представляющих субпопуляцию одного российского города, наблюдающихся с 8 до 20 лет (Russian Children’s Study). Дизайн/Методы. В 2003-2005 гг была сформирована когорта 516 мальчиков 8-9 лет, проживающих в городе Чапаевск, Самарская область (первичный отклик - 90%). Уровень ТХДД, самого токсичного конгенера диоксинов, по которому накоплено наибольшее количество литературных данных влияния на эндокринную систему, был определен в сыворотке мальчиков в 8-9 лет. Через 10 лет юноши с наибольшей (n=4) и наименьшей (n=4) диоксиновой нагрузкой были выбраны для поиска дифференциально метилированных регионов (ДМР) в сперматозоидах, собранных с помощью мастурбации в 18-19 лет. Зрелые сперматозоиды были фракционированы с помощью 50% и 90% сред градиента плотности «Isolate» («Irvine Scientific», США). ДНК сперматозоидов выделена по недавно опубликованному авторами протоколу. Библиотеки для WGBS были приготовлены с использованием 100-150 нг ДНК и набора для метилирования «TruSeq DNA» (Illumina, США) с последующим секвенированием на HiSeq 2500, Illumina. C помощью пакета MethPipe был произведен поиск ДМР со следующими параметрами: минимальная 10Х глубина покрытия, 10% разница метилирования, ≥ 3 CpG на кластер и q<0.05. Результаты. Получено, в среднем, 136 миллионов уникально картированных ридов на один образец при средней глубине покрытия 3X. Мы идентифицировали 52 ДМР в группах с наибольшей (среднее содержание ТХДД в сыворотке 10.4 ±1.8 пг/г липидов) и наименьшей (ТХДД - 0.4 ±0.1 пг/г липидов) перипубертатной экспозицией диоксинами. 56% ДМР располагаются в теле генов, 4% в промоторных, 2% в энхансерных и 38% в межгенных участках. Функциональный анализ обогащения (IPA; Qiagen, Германия) выявил изменение функций, связанных с ранним развитием, клеточной организацией и репликацией ДНК. В наиболее значимой функциональной сети «Клеточная организация, клеточная функция и метаболизм углеводов” центральную регуляторную роль играет эстрогенный рецептор α (ESR1). Выводы. Насколько нам известно, это первое исследование зависимости полногеномного профиля метилирования ДНК в сперматозоидах мужчин от перипубертатной экспозиции стойкими химическими веществами, нарушающими работу эндокринной системы. Эпигенетические изменения в сперматозоидах могут отражать как воздействие окружающей среды, так и возможные механизмы передачи информации через поколение. Данная когорта является уникальной для проспективного изучения процессов мужской фертильности. Финансовая поддержка: грант РНФ #14-45-00065; для родительского Russian Children’s Study – EPA, США #R82943701 и NIH, США ##R01ES0014370. Ключевые слова: химические вещества, нарушающие работу эндокринной системы; эпигенетические изменения; полногеномное бисульфитное секвенирование; метилом сперматозоидов; когорта; Russian Children’s Study; лонгитудинальное исследование.