|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Клонирование, экспрессия гена NDM-1 β-лактамазы и изучение каталитических свойств рекомбинантного ферментадипломная работа (Специалист)
- Научные руководители: Григоренко Виталий Георгиевич, Рубцова Майя Юрьевна
- Автор: Филатова Екатерина Викторовна
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2015
- Аннотация: В настоящее время актуальной является проблема устойчивости микроорганизмов к действию антибиотиков, в первую очередь бета-лактамных. Основной механизм резистентности обусловлен синтезом бактериальных ферментов бета-лактамаз, разрушающих структуру антибиотика. Недавно выделена новая бета-лактамаза NDM-1, способная гидролизовать все типы бета-лактамных антибиотиков. В связи с этим актуальным является детальное изучение этого фермента, что позволит получить информацию, необходимую для создания новых лекарственных средств, которые будут эффективны против микроорганизмов, устойчивых к бета-лактамным антибиотикам. Целью работы было получение рекомбинантной формы бета-лактамазы NDM-1 и изучение ее свойств. В задачи работы входило клонирование гена NDM-1, оптимизация условий его экспрессии в клетках E.coli, выделение и очистка рекомбинантного белка, изучение его свойств и тестирование нового потенциального ингибитора фермента. Результаты работы: 1. Создана система экспрессии гена бета-лактамазы NDM-1 в клетках E.coli, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка в растворимой активной форме. Разработан метод выделения и очистки рекомбинантного фермента. Выход гомогенного препарата белка составил 10 - 15 мг с 1 литра культуры клеток. 2. Определены каталитические параметры рекомбинантной бета-лактамазы NDM-1 по субстратам меропенем, ампицилин, CENTA. Определены каталитические параметры рекомбинантной бета-лактамазы для субстратов ампициллин (KM = 185 мкM, kкат = 462 с-1) и меропенем (KM = 85 мкM, kкат = 154 с-1), которые согласуются с литературными данными. Впервые определены каталитические параметры для субстрата CENTA (KM = 14 мкM, kкат = 308 с-1). 3. Изучено ингибирования унитиолом гидролиза меропенема, катализируемого бета-лактамазой NDM-1. Впервые установлен конкурентный обратимый тип ингибирования. Определено значение константы ингибирования KI = 25 ± 2 мкM.
- Добавил в систему: Григоренко Виталий Георгиевич