|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Исследование редокс-чувствительности белка NCS1дипломная работа (Специалист)
- Научные руководители: Зерний Евгений Юрьевич, Бакшеева Виктория Егоровна
- Автор: Готманова Наталия Николаевна
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2018
- Аннотация: Среди офтальмологических патологий наиболее злокачественными в отношении зрительной функции являются дегенеративные заболевания сетчатки, при развитии которых ключевую роль играет окислительный стресс нейронов этой ткани. Как правило, процесс окислительного повреждения сетчатки начинается с клеток пигментного эпителия и наружных сегментов фоторецепторов, вызывая их апоптоз. Риск развития окислительного стресса фоторецепторов обусловлен высоким потреблением кислорода, интенсивным облучением, индуцирующим фотосенсибилизированные реакции, а также высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот в мембранах этих клеток и отсутствием в них некоторых компонентов антиоксидантной защиты. Все это приводит к увеличению редокс потенциала клеточной среды и окислению фоторецепторных белков, запуская механизмы клеточной гибели. Несмотря на то, что все эти факторы известны достаточно давно, вопрос о конкретных белковых мишенях окислительного стресса фоторецепторов долгое время оставался открытым. Для поиска ответа на этот вопрос ранее в нашей лаборатории была разработана модель светоиндуцированного повреждения сетчатки, в рамках которой производится облучение экспериментальных животных различными дозами видимого света, что позволяет изучать разные фазы механизма фотоповреждения сетчатки, включая апоптоз фоторецепторов. С использованием этой модели было обнаружено, что фотоповреждение сетчатки ассоциировано с окислением двух белков зрительного каскада, аррестина и рековерина, а также, по предварительным данным, еще одного белка – neuronal calcium sensor-1 (NCS1). NCS1 относится к так называемым нейрональным кальциевым сенсорам (НКС) – отдельной, обособившейся в эволюционном процессе группе в составе суперсемейства EF-hand-содержащих Ca2+-связывающих белков. НКС способны изменять конформацию в ответ на связывание Ca2+, тем самым опосредуя передачу сигналов кальция широкому спектру клеточных мишеней. Таким образом, эти белки вовлечены в регуляцию практически всех ключевых процессов, связанных с жизнедеятельностью нейронов, начиная от их роста и выживаемости и заканчивая рецепцией, нейротрансмиссией и всеми этапами синаптической пластичности, вплоть до экспрессии генов. Ярким примером сигнальной системы, регулируемой при участии НКС, является каскад зрительной трансдукции в фоторецепторных клетках сетчатки. К настоящему моменту в зрительной системе достоверно идентифицировано три представителя семейства НКС – рековерин и белки-активаторы гуанилатциклаз. Однако по нашим последним данным к фоторецепторным НКС можно отнести еще один белок – NCS1. Несмотря на то, что NCS1 широко распространен в клетках в нервной системы, где регулирует более двух десятков различных сигнальных партнеров, в фоторецепторных клетках этот белков обнаружен нами впервые и его функция в этом виде клеток пока остается неустановленной. Отличительной структурной особенностью NCS1 и других НКС является наличие в их аминокислотной последовательности высококонсервативного в пределах семейства остатка цистеина. В последнее время накапливается все больше данных указывающих на то, что наличие этого остатка может обуславливать редокс-чувствительность НКС. В NCS1 указанный остаток цистеина является единственным остатком этого типа и, по всей видимости, именно он может обуславливать восприимчивость белка к окислению in vivo. С учетом этих данных, целью настоящей работы являлось установление редокс-статуса фоторецепторного NCS1 при окислительном стрессе, определение условий окисления белка, а также структурная и функциональная характеристика его окисленных форм. Актуальность работы обусловлена тем, что идентификация и функциональная характеристика мишеней окислительного стресса клеток сетчатки, таких как NCS1, позволит установить молекулярные механизмы развития дегенеративных заболеваний этой ткани, что необходимо для разработки подходов к их профилактике и терапии. В работе охарактеризован ряд аспектов функционирования NCS1 в нормальной и патологической фоторецепторных системах, где этот белок обнаружен нами впервые. До начала работы какие-либо данные о функции NCS1 в фоторецептрных клетках в норме, а также о влиянии окисления белка NCS1 на его структурные свойства и регуляторную активность отсутствовали. Все это обуславливает новизну проведенных исследований. В работе впервые показано образование двух окисленных форм NCS1 – дисульфидного димера и окисленного мономера белка, содержащего сульфоновую группу – при светоиндуцированном окислительном стрессе, предшествующем повреждению сетчатки in vivo, а также в условиях лини эукариотических клеток и in vitro. Определены структурные и конформационные свойства NCS1, лежащие в основе чувствительности его остатка цистеина к действию окислителей, а также выявлены внешние условия, способствующие окислению белка, такие как высокая концентрация ионов цинка. Получены очищенные препараты окисленных форм NCS1 (или имитирующие их мутанты), с помощью которых охарактеризованы, в целом, негативные эффекты окисления на термостабильность и разные уровни структуры белка. Наконец охарактеризовано влияние окисления на функционирование NCS1 в реконструированной системе, построенной с использованием компонентов фоторецепторной клетки. Показано, что окисление может производить комплексный эффект на режим действия белка в клетке, смещая Са2+-чувствительность его мембранной ассоциации в сторону высоких концентраций катиона (>10 мкМ) с одновременным усилением его регуляторной активности в отношении мишеней за счет улучшения их связывания. На основании полученных данных предположена гипотетическая схема регуляторной активности окисленных форм NCS1 в фоторецепторной клетке. Таким образом, результаты работы не только впервые указывают на роль NCS1 как Са2+/редокс-сенсора в сигнальном ответе фоторецепторной клетки на светоиндуцированный окислительный стресс, но и в целом расширяют понимание механизмов функционирования этого важнейшего нейронального белка.
- Добавил в систему: Зерний Евгений Юрьевич