Аннотация:1. Проведена оптимизация экспрессии оксидазы D аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis в клетках E.coli. Выход активного фермента составил 13000 Ед с литра среды или 7% от общего растворимого белка E.coli.
2. Разработаны методы очистки рекомбинантного фермента, получены препараты TvDAAO с чистотой не менее 90-95%.
3. Изучены кинетические свойства рекомбинантного фермента. Показано, что при концентрациях выше 20 мкг/мл зависимость активности TvDAAO от её концентрации не является линейной. Показано, что TvDAAO стабильна в диапазоне рН 6,0– 9,0.
4. Исследована термостабильность рекомбинантного фермента в диапазоне 50-60 оС. Показано, что кинетика инактивации сильно зависит от концентрации фермента. При концентрациях ниже 20 мкг/мл инактивация протекает, по крайней мере, в две стадии. Константа скорости второй стадии процесса не зависит от концентрации белка. Анализ температурной зависимости в соответствии с теорией активированного комплекса позволил определить активационные параметры
DH# = (330 ± 10) кДж/моль, DS# = (410 ± 40) Дж/(моль*К).
Предложена общая схема инактивации фермента при различных концентрациях.
5. На основе компьютерного расчета получены модельные структуры мономера и димера DAAO из дрожжей T. variabilis.