|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
ВВЕДЕНИЕ ПРИРОДНЫХ ДИСУЛЬФИДНЫХ МОСТИКОВ В СТРУКТУРУ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ Escherichia coli И ИХ ВЛИЯНИЕ НА КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ И СТАБИЛЬНОСТЬдипломная работа (Бакалавр)
- Научный руководитель: Панин Николай Владимирович
- Автор: Панина Анна Михайловна
- Тип: Бакалавр
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2020
- Аннотация: Объектом настоящего биотехнологического исследования является фермент пенициллинацилаза (ПА) из Escherichia coli. Фермент относится к суперсемейству гидролаз с N-концевым нуклеофилом (Ntn) и широко используется в биотехнологии бета-лактамных антибиотиков для получения бета-лактамных ядер. Более широкое применение пенициллинацилазы E.coli в биотехнологии ограничено, в том числе, вследствие её низкой термо-, pH- и операционной стабильности в условиях препаративного синтеза. Расширение биотехнологического потенциала фермента за счет увеличения его стабильности является традиционной, но в то же время одной из наиболее актуальных задач современной энзимологии. Изучение возможностей стабилизации ПА E.coli является основным предметом работы и определяет прикладную значимость данного исследования. Одним из возможных методов стабилизации ферментов является введение в структуру белковой глобулы дисульфидных мостиков (Dombkowski et al., 2014; Trivedi et al., 2009). Существующие подходы дизайна искусственных дисульфидных мостиков методически нацелены на улучшение термостабильности, и их использование для улучшения pH- и операционной стабильности не всегда обоснованно. При этом, лишь в редких случаях в результате трудного эмпирического подбора удается подобрать стабилизирующие фермент мутации, и наряду с ними встречаются дестабилизирующие замены (Le et al., 2012). В то же время природные дисульфидные мостики не должны оказывать дестабилизирующего действия на структуру, к тому же они обладают более широким потенциалом для стабилизации в экстремальных условиях синтеза - в соответствии с теми структурными и функциональными ролями, которые они играют в природе. Поиск таких природных дисульфидных замен, которые можно гарантированно «скопировать» в структуру фермента, является актуальной задачей современной биотехнологии. В данной работе впервые используется оригинальная методология yosshi, разработанная сотрудниками отдела биокинетики НИИФХБ им. А. Н. Белозерского для структурно опосредованного поиска природных дисульфидных мостиков в белковых суперсемействах. Метод уверенно предсказывает описанные в литературе дисульфидные мостики, способствующие увеличению термостабильности. В то же время, он обладает потенциалом для поиска мостиков, которые могли бы привести к увеличению pH- и операционной стабильность. Использование сервера yosshi для исследования возможностей стабилизации ПА E.coli в условиях препаративного синтеза за счет копирования природных дисульфидных мостиков представляется оптимальным. Настоящая работа, являясь в первую очередь битехнологическим исследованием, представляет также фундаментальный интерес для установления возможной роли дисульфидных мостиков в структуре белков суперсемейства Ntn-гидролаз, а валидация метода на конкретном природном объекте с целью определения новых возможностей и ограничений метода yosshi придает методологическую значимость и новизну данному исследованию. Цель работы – изучение возможности стабилизации ПА E.coli, при высоких значениях pH, температуры и концентрации субстрата, за счет копирования в ее структуру природных дисульфидных мостиков из родственных ферментов.
- Добавил в систему: Панин Николай Владимирович