Аннотация:В настоящее время во всем мире наблюдается тенденция к поиску новых способов получения ферментов, способных применяться в биотехнологических целях. В этой связи особое место занимают аскомицетные грибы как продуценты таких ферментов. Аскомицеты - это микроорганизмы, один из крупных классов высших грибов, половое размножение которых происходит посредством спор, развивающихся в сумке (аске). Они обладают большим потенциалом для производства первичных и вторичных метаболитов (лимонная кислота, компоненты биотоплива, антибиотики, таксол) и некоторых внеклеточных ферментов, таких как амилазы, липазы и протеазы, с помощью которых они получают питательные вещества и строительный материал из внешней среды.
Занимая две трети мирового рынка ферментов, протеазы используются во многих отраслях промыленности, таких как фармацевтическая, кожевенная, пищевая, а также в производстве моющих средств [1]. В пищевой промышленности протеазы используются в различных процессах, например, при производстве сыра, хлебобулочных изделий и в обработке мяса. Использование протеолитических ферментов в кожевенной промышленности заменило токсичные и опасные для окружающей среды химические реагенты. В медицинских целях протеазы можно использовать для лечения различных заболеваний, таких как рак, воспалительные заболевания, глаукому и т.д. Недавно в кожных покровах были идентифицированы кислые протеазы, связанные с процессом естественного отшелушивания кожи. Поэтому те из них, что способны вызывать отшелушивание, часто входят в состав эксфолиантов в косметических продуктах [2]. Также на использование протеаз в производстве моющих средств приходится около 20% рынка коммерческих ферментов.
Аскомицетные грибы считаются уникальными клеточными фабриками по производству белка и являются наиболее доминирующим источником протеаз из-за высокой эффективности секреции и превосходной способности к посттрансляционным модификациям. По сравнению с прокариотами, мицелиальные грибы обладают развитыми системами посттрансляционного процессинга (например, гликозилирование, возможность специфического расщепления протеазами для дифференцировки белков, а также образование дисульфидных связей) [3], которые необходимы для обеспечения активности белков. Мицелиальные грибы образуют обширную экологическую группу грибов с разнообразным синтезирующим потенциалом. Помимо использования этих микроорганизмов в качестве продуцентов ферментов, их собственные гены наиболее активных ферментов могут быть использованы для создания рекомбинантных микроорганизмов. Одной из целью данной работы является поиск таких генов протеолитических ферментов в промышленно значимом организме Penicillium verruculosum.
Ранее признанным недостатком мицелиальных грибов как продуцентов рекомбинантных белков является их общая способность продуцировать гомологичные протеазы, которые могут расщеплять продуцируемые рекомбинантные ферменты. Стратегии, применяемые по предотвращению протеолитической деградации, включающие добавление ингибиторов протеаз [4], регулирование pH культуральной жидкости, делая его отличным от рН-оптимума нежелательных протеаз [5], имели ограниченный успех. В дополнение к внеклеточно секретируемым протеазам мицелиальные грибы обладают сильным внутриклеточным протеолитическим комплексом, компоненты которого могут высвобождаться в процессе естественного лизиса культуры на поздних этапах ферментации, и разработка стратегий по его уменьшению ведет к снижению высвобождения внутриклеточных протеаз, также способных атаковать рекомбинантный белок. Однако альтернативным решением может служить разработка мутантов, дефицитных по самым активным протеазам, в том числе внутриклеточных. Учитывая, что мицелиальные грибы могут содержать до 80 протеолитических генов с различной известной и неизвестной функцией [6], данная работа представляет особый интерес для выявления функций ранее неохарактеризованных протеаз в Penicillium verruculosum.
В настоящей работе был произведен in silico анализ генома на наличие таких вне- и внутриклеточных протеаз, получен мутантный штамм-продуцент выбранной протеазы-аналога аспергиллопепсина (76%) и проведен анализ ее биохимических свойств.
Выводы
• В настоящей работе проведен in silico анализ по идентификации генов потенциальных внеклеточных протеаз, их последовательности сопоставляли с гомологами в базе данных NCBI. Таким образом был обнаружен пенициллопепсин PepA. Впоследствии in vitro ингибиторный анализ показал, что протеаза принадлежит к семейству аспарагиновых протеаз, как и предсказывал предварительный анализ аминокислотной последовательности.
• Осуществлено клонирование гена протеазы из генома P. verruculosum 537 под контроль cbh1 промотора. Таким образом, был создан штамм-продуцент кислой аспарагиновой протеазы посредством трансформации нативного штамма Penicillium verruculosum B1-537 полученной плазмидой pUC-CBHI-PepA, несущей целевой ген.
• Полученный рекомбинантный штамм Penicillium verruculosum B1-537(PepA)-19 показал максимальную продуктивность по общему белку 10 г/л в условиях ферментации в колбах и 27 г/л в условиях лабораторного ферментера.
• Была разработана технология очистки исследуемого фермента до гомогенного состояния. Для чистого фермента удельная активность составила 38.5 ед/мг.
• Определены pH и температурный оптимумы протеолитической активности фермента, которые составили 2.5 и 65 °С, соответственно. Кроме того, фермент показал высокую температурную стабильность. Период полуинактивации при 60оС составил 50 минут.
• Были определены сопоставимые с промышленными протеазами каталитические параметры (KM = 3.4 ± 0.4 мг/мл, Vmax = 33 ± 2 мг/мл/мин, kcat = 38.5 ± 2.6 c-1). Исходя из высокой термостабильности и способности сохранять активность в широком диапазоне значений рН можно предположить, что исследуемый фермент является перспективным кандидатом для использования в разных областях пищевой промышленности.
1. Nirmal N. Fungal proteases: An overview // International journal of Biotechnology & Bioscience. 2011. Vol. 1. P. 1–40.
2. Smith W.P. et al. Topical proteolytic enzymes affect epidermal and dermal properties // Int J Cosmet Sci. 2007. Vol. 29, № 1. P. 15–21.
3. Karnaukhova E. et al. Expression of human α1-proteinase inhibitor in Aspergillus niger // Microb Cell Fact. 2007. Vol. 6.
4. Ahamed A., Singh A., Ward O.P. Culture-based strategies for reduction of protease activity in filtrates from Aspergillus niger NRRL-3 // World J Microbiol Biotechnol. 2005. Vol. 21, № 8–9. P. 1577–1583.
5. Wang L. et al. Bioprocessing strategies to improve heterologous protein production in filamentous fungal fermentations // Biotechnology Advances. Elsevier Inc., 2005. Vol. 23, № 2. P. 115–129.
6. Machida M. Progress of Aspergillus oryzae genomics // Adv Appl Microbiol. 2002. Vol. 51. P. 81–106.
