ИСТИНА

Цели исследования. Целью данной работы являлась разработка методики получения рекомбинантной ТОР с повышенной эффективностью рефолдинга, исследование свойств рекомбинантного фермента и изучение возможности его применения в качестве ферментной метки для иммуноанализа, а также как основного компонента безреагентных биосенсоров. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: - оптимизация условий проведения рефолдинга рекомбинантной TOP для повышения выхода активного фермента; - получение конъюгатов рекомбинантной TOP с антивидовыми антителами козы против IgG мыши и сравнение полученных конъюгатов с аналогичными, но содержащими HRP в качестве метки, при проведении иммуноферментного анализа с колориметрической и хемилюминесцентной детекцией; - изучение влияния способа иммобилизации на электрохимические свойства рекомбинантной TOP при создании биосенсоров с прямым переносом электронов. Научная новизна. В ходе выполнения данной работы впервые было проведено систематическое изучение влияния различных параметров на эффективность ренатурации рекомбинантной ТОР in vitro. Показано, что наибольшее влияние на выход активной ТОР при ренатурации из телец включения оказывает концентрация апо-фермента в рефолдинг-среде. Впервые для рефолдинга рекомбинантной пероксидазы был использован метод гель-фильтрации. Сравнение двух методов ренатурации (метода разведения и гель-фильтрации) показало, что рефолдинг TOP на гель-фильтрационной колонке значительно менее эффективен. Изучено влияния ионов кальция на протекание рефолдинга и на свойства рекомбинантной TOP. Показано, что инкубация фермента в присутствии ионов кальция приводит к снижению каталитической активности по отношению к различным ароматическим субстратам. Впервые показан стабилизирующий эффект ионов кальция при термоинактивации ТОР. Подобран метод и синтезированы конъюгаты TOP с антителами, которые были использованы для проведения иммуноанализа. Показано, что модификация аминогрупп TOP в процессе конъюгации не приводит к падению активности фермента. Впервые изучено влияние химической иммобилизации на электрохимические свойства TOP. Показано, что ковалентная иммобилизация ТОР на поверхности графитового электрода позволяет существенно повысить отклик биосенсора и операционную стабильность фермента. Практическая значимость работы. Оптимизация условий проведения рефолдинга рекомбинантной TOP позволила значительно увеличить выход активного фермента, что крайне важно с точки зрения возможности практического применения. Показано, что использование конъюгатов антител с рекомбинантной TOP дикого типа и мутантной формой TOP-F140Y приводит к повышению интенсивности сигнала при проведении иммуноанализа как с колориметрической регистрацией, так и с детекцией по хемилюминесценции, а также обеспечивает большую чувствительность анализа. Было достигнуто существенное улучшение характеристик безмедиаторного биосенсора на основе TOP (в частности, интенсивности электрокаталитического сигнала, операционной стабильности иммобилизованного фермента и ширины линейного диапазона определения пероксида водорода) при применении нового протокола химической иммобилизации фермента на поверхности графитового электрода. Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на следующих международных конгрессах, конференциях и школах: VII и VIII Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2013 и 2015), XIV Международная конференция молодых ученых «Леса Евразии» (Вологда, Россия, 2014), International BioForum-2014 (Пущино-на-Оке, Россия, 2014), 10th International Conference on Protein Stabilization (Стреза, Италия, 2014), International Conference OxiZymes (Вена, Австрия, 2014), XXI International Conference INPEC-2014 (International Network of Protein Engineering Centers) (Санкт-Петербург, Россия, 2014), International Conference "Biocatalysis 2015: Fundamentals and Applications" (Московская область, Россия, 2015). Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 печатных работ: 3 статьи (все журналы входят в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК РФ) и 9 тезисов докладов конференций. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 159 страницах и содержит 70 рисунков, 9 таблиц и 260 ссылок.