ИСТИНА

Актуальность проблемы. Аналоги нуклеозидов/нуклеотидов широко используются в клинике для лечения социально значимых заболеваний, вызванных такими опасными вирусами, как вирус иммунодефицита человека, вирусы герпеса 1 и 2 типов, цитомегаловирус, и другие. Нуклеозидные и нуклеотидные аналоги – это синтетические химически модифицированные соединения, миметики природных нуклеозидов, которые в результате структурных биотрансформаций в клетке встраиваются в ДНК или РНК и ингибируют вирусную репликацию или клеточное деление. Помимо встраивания в нуклеиновые кислоты, они могут взаимодействовать и ингибировать важные ферменты метаболизма нуклеиновых кислот, такие как нуклеотидполимеразы вирусов и человека, киназы, рибонуклеотидредуктазы, ДНК-метилтрансферазы, пуриновые или пиримидиновые нуклеозидфосфорилазы и другие. Для более эффективного подавления многих вирусных заболеваний, в частности, ВИЧ-инфекции, применяется комбинированная терапия – одновременное использование нескольких типов препаратов, направленных на разные вирусные мишени. ВИЧ-инфицированные больные часто ко-инфицированы другими вирусами, например, более 80% из них страдают от сопутствующего вируса герпеса. Проводятся поиски соединений, одновременно подавляющих несколько типов вирусов, возможности улучшения свойств уже применяемых лекарств: снижения их токсичности для неинфицированных клеток и уменьшения кратности приёма, а также изучение эффектов аддитивности и синергизма препаратов. За последние десятилетия были созданы эффективные антивирусные препараты на основе аналогов нуклеозидов, ставшие основой высокоактивной антиретровирусной терапии. В организме они проходят каскад фосфорилирования клеточными киназами до трифосфатов, которые являются субстратами обратной транскриптазы ВИЧ, встраиваются в растущую цепь ДНК и терминируют репликацию вируса. Биологическая активность таких соединений зависит в значительной степени от структуры и конформации сахарного фрагмента. Против некоторых типов вирусов получили распространение ациклические производные нуклеозидов и нуклеотидов с измененными фрагментами рибозного цикла, которые, в основном, имеют схожий с рибозосодержащими нуклеозидами механизм действия на полимеразы вирусов. Обладая отличными от природных конформаций диэдральными углами и степенями свободы, ациклические нуклеозидные аналоги могут проявить бóльший спектр активности против нескольких типов вирусов, а введение фосфонатного остатка позволяет имитировать фосфат нуклеотида и не нуждаться в первой (обычно лимитирующей) стадии фосфорилирования, оставаясь стабильным в биологических средах. Тем не менее, многим из применяемых препаратов присущи недостатки, такие как плохая растворимость, токсические побочные эффекты при длительном использовании препаратов, а также неизбежное возникновение резистентных к ним штаммов вируса, что приводит к значительному снижению эффективности имеющихся лекарственных средств. Одним из способов решения этих проблем является синтез биодеградируемой депо-формы лекарственных препаратов. В качестве удачных примеров можно назвать анти-ВИЧ препарат тенофовир дизопроксил фумарат (Viread™), являющийся депо-формой ациклического аналога аденозина, а также 5’-H-фосфонат 3’-азидо-3’-дезокситимидина – фосфазид (Никавир®) – первый отечественный анти-ВИЧ препарат, созданный в нашей лаборатории. Их применение позволило снизить побочные эффекты исходных нуклеозидов, продлить время нахождения в организме и уменьшить кратность приёма в сутки. Таким образом, синтез новых ациклических фосфонатных производных нуклеозидов и создание различных депо форм ингибиторов репликации вирусов считается перспективным направлением развития антивирусной терапии. Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ИМБ РАН по поиску прототипов лекарственных средств с антивирусной активностью (программа «Молекулярная и клеточная биология») и при финансовой поддержке грантов РФФИ (12-04-00581-а и 14-04-31163-мол_а). Целью работы было создание ингибиторов репликации ВИЧ и других сопутствующих ему вирусов на основе ациклических фосфонатных нуклеозидов и депо-форм нуклеозидных аналогов Задачами работы являлись 1) синтез новых карбаматных и фосфонатных депо-форм известных анти-ВИЧ препаратов зидовудина (3’-азидо-3’-дезокситимидина, AZT) и ламивудина (L-2’,3’-дидезокси-3’-тиацитидина, 3ТС) и изучение их антивирусной активности и токсичности на клетках, а также отдельных соединений на животных моделях; 2) разработка схем синтеза и получение новых ациклических фосфонатных производных аденина и гуанина, содержащих оксимный фрагмент в цепи, изучение их антивирусной активности в культурах клеток, инфицированных ВИЧ, вирусами герпеса и гепатита С, определение токсичности соединений на неинфицированной культуре клеток. Научная новизна Предложены методы синтеза карбаматных и бис-нуклеозидфосфонатных производных и осуществлен их синтез. При этом впервые получен смешанный бис-нуклеозидфосфонат AZT и 3TC, содержащий при одном фосфонатном остатке два различных нуклеозидных аналога с анти-ВИЧ активностью. Разработана методика получения фосфонатных ациклических аналогов нуклеотидов с оксимным фрагментом в цепи, предложены оптимизация синтеза, детекция и очистка соединений для повышения выхода целевых продуктов. Практическая ценность Данная диссертационная работа расширяет опыт синтеза пролекарственных препаратов на основе нуклеозидных аналогов и даёт достаточно полное представление о фармакокинетических характеристиках новых фосфонатных и карбаматных производных известных анти-ВИЧ препаратов. Синтез ациклических нуклеотидных аналогов обычно индивидуален для каждого отдельного типа структуры, однако предложенный в работе подход обладает универсальностью и позволяет не только в дальнейшим расширять ряд оксимных производных, измененяя заместители боковой цепи, но и использовать ключевой интермедиат для функционализации фосфонатным остатком любого карбонил-содержащего производного через “click”-реакцию синтеза оксимов. Выход интермедиата удалось повысить вдвое по сравнению с описанными методиками его синтеза, а также выявить новые способы детекции О-замещенных гидроксиламинов. Степень достоверности и апробация работы Строение и чистота полученных соединений подтверждены данными 1H, 13C, 31P и 15N ЯМР спектроскопии, в том числе с использованием методов 2D (COSY, HSQC и HMBC) ЯМР, УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения. Основные положения диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: 2nd Russian Conference on Medicinal Chemistry «MedChem-2015» (г. Новосибирск, 2015), 28th International Conference on Antiviral Research «ICAR-2015» (Италия, г. Рим, 2015), Innovative Approaches for Identification of Antiviral Agents Summer School «2nd IAAASS» (Италия, Санта Маргерита ди Пула, 2014), 15th Tetrahedron Symposium – Challenges in Bioorganic & Organic Medicinal Chemistry (Великобритания, г. Лондон, 2014), Первая Российская конференция по медицинской химии «MedChem Russia» с международным участием (г. Москва, 2014), Congress of the Federation of European Biochemical Societies – Mechanisms in Biology «38th FEBS» (г. Санкт-Петербург, 2013), Весенний и осенний финалы по программе «У.М.Н.И.К.» РАН (г. Москва, 2012), IV Всероссийский научно-практический семинар молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (г. Волгоград, 2012). Публикации По материалам диссертации опубликовано 5 статей в реферируемых журналах, 9 тезисов в материалах отечественных и зарубежных конференций и получен один патент Российской Федерации. Работа выполнена в лаборатории Молекулярных основ действия физиологически активных соединений Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.