ИСТИНА

Впервые получены 13 мутантных форм E.coli (EcПА) с заменами в области субстрат-связывающего кармана и активного центра фермента. Показано, что введенные мутации по-разному влияют на каталитические параметры мутантов в реакциях синтеза ампициллина и реакциях стереоселективного гидролиза амидов. Клонирован ген новой ПA из A.faecalis VKM-B1518 (AfПА-VKM). Показано, что, несмотря на отличия в аминокислотной последовательности, клонированный фермент по своим кинетическим свойствам не отличается от ранее известных AfПA. Нуклеотидная последовательность гена AfПА-VKM-B1518 аннотирована в базу данных GenBank под номером FJ042491. Впервые для AfПA проведено систематическое исследование механизма термоинактивации. Показан мономолекулярный механизм и определены термодинамические активационные параметры процесса. Построена компьютерная модель трехмерной структуры пенициллинацилазы из A.faecalis VKM-B1518. На основе полученной модельной структуры предложены варианты сшивок для получения пермутированного фермента. Получены мутантные формы EcПА с улучшенными каталитическими характеристиками в реакциях синтеза ампициллина и амоксициллина и в реакциях стереоселективного синтеза/гидролиза амидов. Клонированный ген AfПА является патентно чистым. На его основе создан штамм-продуцент рекомбинантного фермента. Оптимизированная система экспрессии рекомбинантной AfПА в клетках E.coli позволяет получать до 5000 Ед с литра среды. Построение модельной структуры AfПА создало основу для проведения экспериментов по его белковой инженерии.