ИСТИНА

Впервые клонирован и экспрессирован в клетках E.coli в активной растворимой форме ген ФДГ пекарских дрожжей. Ранее свойства этого фермента не были описаны в литературе. Показано, что наблюдаемый механизм термоинактивации SceФДГ кардинально отличается от известных для других ФДГ механизмов. Процесс происходит по двухстадийной схеме с первой обратимой и второй необратимой стадиями. Обнаружена существенная стабилизация фермента ионной силой. Показано, что кинетическое поведение SceФДГ при различных рН в целом аналогично поведению других дрожжевых ФДГ. Однако при щелочных рН для SceФДГ наблюдалась немихаэлисовская кинетика по формиат-иону. Получен ряд мутантов Sce- и PseФДГ. На основе результатов изучения свойств данных мутантов сделаны выводы о влиянии остатков Pro в различных участках белка на стабильность и кинетические свойства ФДГ. Показано, что одна точечная замена (V323P в SceФДГ) может приводить к изменению характера связывания субстратов (появлению немихаэлисовской кинетики по NAD+ и формиат-иону при рН 7). Оптимизация конформации полипептидной цепи позволила повысить термостабильность дрожжевой и бактериальной ФДГ. Показано, что в отличие от PseФДГ, фермент пекарских дрожжей проявляет аб¬солютную специфичность по отношению к NAD+. На основе структуры PseФДГ построена трехмерная модель SceФДГ и выявлены причины низ¬ко¬го сродства дрожжевой ФДГ к NADP+. Введение двух аминокислотных замен в ген SceФДГ привело к получению первой NADP+-селективной эукариотической ФДГ.