ИСТИНА

Актуальность проблемы. Ионы Ca2+ являются одним из универсальных регуляторов энергетического метаболизма (McCormack, Denton, 1990) и могут служить проводниками сигналов из цитозоля (Joseph, et al., 1984; Exton, 1988) в матрикс митохондрий (Brini, Carafoli, 2000). К настоящему времени известно, что поглощение Ca2+ является инвариантной функцией митохондрий позвоночных (Carafoli, Lehninger, 1971; McCormack, Denton, 1993), а также растений, грибов и простейших (Chen, Lehninger, 1973; Docampo, Vercesi, 1989; Bazhenova, et al., 1998). Это указывает на исключительную важность митохондриального транспорта Ca2+ для поддержания жизнедеятельности организмов (Duchen, 1999; Pozzan, Rizzuto, 2000; Brini, Carafoli, 2000). Низкоамплитудные изменения концентрации Ca2+, по-видимому, активируют Ca2+-транспортирующие системы плазмалеммы и эндоплазматического ретикулума (Blaustein, et al., 1978; Joseph, et al., 1983). При появлении больших концентраций Ca2+ (Herrington, et al., 1996; Montero, et al., 2000) и/или продолжительном повышении уровня Ca2+ цитозоле (Nicholls, Budd, 1998) Ca2+-сигнал передается внутрь митохондрий, что приводит к активации окислительного метаболизма (Robb-Gaspers, et al., 1998; Hansford, Zorov, 1998) и обеспечивает защиту от перегрузки цитозоля ионами Ca2+ (Khodorov, et al., 1996). Исследование кинетики митохондриального транспорта Ca2+ необходимо для понимания механизма, обеспечивающего амплитудно-частотную селективность проведения Ca2+-сигналов из цитозоля в митохондриальный матрикс. Перенос Ca2+ по электрохимическому градиенту через внутреннюю мембрану митохондрий обеспечивает так называемый Ca2+-унипортер, чувствительный к катионам лантанидов и рутениевому красному (Saris, Åkerman, 1980). Несмотря на то, что поглощение Ca2+ в митохондрии из разных источников изучается уже около полувека (De Luca, Engstrom, 1961; Pozzan, Rizzuto, 2000), молекулярная структура унипортера до сих пор не установлена, а кинетические параметры «переносчика» по данным разных лабораторий чрезвычайно варьируют и часто противоречивы. Систематическое исследование кинетики транспорта Ca2+ митохондриями было начато в начале 70-х годов. В 1971 г. Bygrave, Reed и Spencer, используя измерения накопления 45Ca2+ в митохондрии печени, обнаружили «кооперативную» зависимость скорости транспорта от его концентрации. Два года спустя Vinogradov и Scarpa (1973) провели детальный анализ кинетики накопления Ca2+ и Mn2+ в митохондрии печени при помощи быстро-регистрирующей фотометрии с применением непроникающего в матрикс металлохромного индикатора мурексида. Ими было показано, что начальные скорости поглощения Ca2+ и Mn2+ в митохондрии сигмоидально зависят от концентрации этих катионов. Было установлено, что сигмоидная кинетика транспорта Mn2+ исчезает после кратковременной преинкубации митохондрий с небольшими концентрациями Ca2+. Авторы впервые предложили кинетическую модель функционирования унипортера, согласно которой переносчик функционально активен при связывании двух ионов переносимого катиона (Vinogradov, Scarpa, 1973). С 1973 г. в литературе было опубликовано множество работ, в которых кинетические параметры транспорта (кажущаяся величина «Km» и значения максимальных скоростей) и само существование кооперативности варьировали в очень широких пределах (Reed, Bygrave, 1975; Hutson, 1977; Åkerman, 1977; Bragadin, et al., 1979; Affolter, Carafoli, 1981). В 1986 г. Лейкиным и Гонсальвес с использованием изотопного и спектрофотометрического методов регистрации было показано, что удаление Ca2+ из внешней среды приводит к ингибированию выхода предварительно накопленного Ca2+ из разобщенных митохондрий (Лейкин, Гонсальвес, 1986). В это же время Крёнер независимо показал, что продолжительная инкубация деэнергизованных митохондрий печени с ионами Ca2+ ускоряет поглощение 45Ca2+ в митохондрии после их энергизации (Kröner, 1986). Из этих наблюдений логически следовало, что для функционирования унипортера необходимо специфическое связывание «активирующего» катиона - вывод, хорошо соответствующий ранее предложенной модели кооперативного переноса Ca2+ через внутреннюю мембрану митохондрий (Vinogradov, Scarpa, 1973). Ни механизм Ca2+-зависимой активации транспорта Ca2+, ни его физиологическая значимость до настоящего времени оставались неизвестными. В настоящей работе на основании измерений скоростей транспорта Ca2+ митохондриями печени в различных «начальных» условиях предложена модель функционирования Ca2+-унипортера, непротиворечиво объясняющая кажущуюся кооперативность транспорта и вариации параметров накопления двухвалентных катионов митохондриями. Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследование причин кинетической вариабельности транспорта двухвалентных катионов митохондриями. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи: 1. Исследование кинетики активации и деактивации Ca2+-унипортера. 2. Анализ влияния активации Ca2+-унипортера на кинетику поглощения двухвалентных катионов. 3. Определение вклада реакций активации и транспорта в формирование ряда катионной специфичности Ca2+-унипортера. Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое исследование кинетики Ме2+-зависимой активации митохондриального Ca2+-унипортера. Определены величины кажущихся констант диссоциации комплексов Ca2+, Sr2+ и Mn2+ для «активационных» и транспортных центров переносчика. Показано, что специфичность транспорта катионов в значительной степени определяется стадией активации. Предложена модель механизма кинетической кооперативности электрогенного транспорта двухвалентных катионов. Главное в модели - медленный переход между неактивным и активным состояниями канала, что позволяет рассматривать Ca2+-унипортер в качестве фильтра, обеспечивающего амплитудно-частотную селективность проведения Ca2+-сигнала из цитозоля в матрикс митохондрий. Поскольку канал не обладает абсолютной субстратной специфичностью, способность Ca2+-унипортера к деактивации в отсутствие субстрата может оказаться способом предотвращения неспецифического разобщения. С другой стороны, неспецифические утечки, индуцируемые физиологическими концентрациями субстрата (Ca2+), могут контролировать мягкое разобщение митохондрий (Skulachev, 1996). Практическая значимость работы. Материалы диссертационной работы используются в спецсеминарах «Избранные главы биохимии», а также при проведении занятий по «Функциональной биохимии» в рамках большого практикума для студентов-биохимиков. В ходе выполнения работы были разработаны методы получения интактных митохондрий с пониженным содержанием Ca2+ и очистки используемых в работе сред от примесного Ca2+. Предложены простые способы получения митохондрий с активированным и деактивированным Ca2+-унипортером. Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на Международном симпозиуме “Мембранная биоэнергетика” (Москва, 1995), на III, IV и V Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам “Ломоносов” (Москва, 1996, 1997, 1998), на Втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), на заседании кафедры биохимии МГУ (Москва, 1999); на Международной конференции «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода» (Пущино, 2000). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы. Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания материалов и методов исследования (4 главы), результатов исследования (4 главы), обсуждения результатов исследования, выводов и списка литературы. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 33 рисунка. Список литературы включает 204 ссылки. В Ы В О Д Ы. 1. Предложена модификация процедуры получения интактных митохондрий из печени крысы методом дифференциального центрифугирования, позволяющая снизить содержание эндогенного Ca2+ до 0.5 нмоль/мг белка. 2. Исследовано взаимодействие кинетики активации Ca2+-унипортера митохондрий в присутствии Ca2+, Sr2+ и Mn2+ и транспорта этих катионов. Определены величины кажущихся констант диссоциации комплексов Ca2+, Sr2+ и Mn2+ с активационными и транспортными центрами Ca2+-унипортера митохондрий. Соотношение этих констант указывает на то, что ряд специфичности транспорта катионов формируется в большей степени на стадии активации, и в меньшей - при транслокации. 3. Активационный центр Ca2+-унипортера обращен в межмембранное пространство. Активация унипортера обусловлена медленным переходом из неактивной формы в активную и происходит независимо от энергизации митохондрий в соответствии с кинетикой обратимых реакций псевдопервого порядка. Начальная скорость транспорта Ме2+ в митохондрии с неактивированным унипортером равна нулю. 4. Скорость активированного транспорта Ca2+ более чем на порядок превышает скорости переходов Ca2+-унипортера из неактивного состояния в активное и обратно. 5. Кинетические параметры насыщения скоростей транспорта Ме2+ определяются концентрацией активирующего Ме2+ и продолжительностью активации. После установления равновесия между неактивной и активной формами унипортера транспорт Ме2+ (при небольших его концентрациях) происходит в соответствии с кинетикой псевдопервого порядка. 6. Предложена модель функционирования Ме2+-унипортера в митохондриальной мембране.