ИСТИНА

Хорошо известно, что продукты восстановления кислорода – пероксид водорода, супероксид-радикал и гидроксил-радикал токсичны для клеток и приводят к повреждению клеточных макромолекул. Для снижения токсичного эффекта кислорода аэробы и факультативные анаэробы содержат ферменты антиокислительной защиты, важнейшими из которых являются каталаза и супероксиддисмутаза (СОД). Ранее считали, что строгие анаэробы не обладают подобными ферментами и, соответственно, не способны к перенесению окислительного стресса. Тем не менее, за последние 30 лет были получены многочисленные данные по наличию в клетках строгих и даже строжайших анаэробов каталазы и СОД. Отсутствие каталазной активности у ряда анаэробных микроорганизмов оставляет открытым вопрос, является ли это следствием отсутствия гена или же экспрессии соответствующего гена только при определенных условиях. Широкое, в отличие от каталазы, распространение СОД у облигатных анаэробов поставило вопрос о её физиологической роли и происхождении у этих организмов. По всей видимости, синтез ферментов антиокислительной защиты индуцируется молекулярным кислородом или продуктами его восстановления, что обеспечивает анаэробному организму защиту от летального действия кислорода при попадании в аэробные условия. Вероятно, основная физиологическая роль СОД у анаэробных микроорганизмов, так же как и у аэробных, состоит в предотвращении кислородных повреждений клеток путем нейтрализации реакционноспособного свободного супероксид-радикала. СОД может являться существенным фактором вирулентности, позволяющим патогенным анаэробам существовать в аэробных тканях до возникновения подходящих безкислородных условий, обеспечивающих рост этих микроорганизмов. Физиологический ответ на кислородный стресс в клетках микроорганизмов достаточно сложен и тонко регулируем. Однако имеется мало информации относительно молекулярных механизмов адаптивного ответа на окислительный стресс у строго анаэробных микроорганизмов, обеспечивающего их аэротолерантность и выживаемость в присутствии кислорода или продуктов его восстановления. Вопросы о регуляции системы антиокислительной защиты у строгих анаэробов в условиях различных окислительных стрессов, а также о количестве вовлекаемых в адаптивный ответ генов, также остаются открытыми. В связи с этим представляется чрезвычайно важным и интересным изучение ферментов антиокислительной защиты, а также их регуляции у метаногенов - древнейших микроорганизмов, сохранивших многие черты исходных предковых форм и существующих в экстремальных условиях строжайшего анаэробиоза. Тем не менее, считается доказанным, что метаногены способны существовать в местообитаниях, где присутствуют аэробные микрозоны или временно возникают аэробные условия. Высказываются предположения, что Fe-cодержащие CОД, обнаруженные в клетках метаногенов, являются предшественниками СОД прокариот и прямыми «потомками» исходной СОД уркариот. Однако существуют и гипотезы о различных параллельных эволюциях СОД некоторых метаногенов и известных бактериальных Fe-содержащих СОД. Необходимо отметить, что работы по очистке и изучению свойств каталаз метаногенных архей, а также по клонированию и секвенированию соответствующих kat генов начались только в последнее время. Желание обобщить подчас противоречивые данные по ферментам антиокислительной защиты у строгих анаэробов и продолжить исследования каталаз и СОД у строжайших анаэробов – метаногенных архей определило цель настоящей работы. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение ферментов антиокислительной защиты (каталазы и СОД) у метаногенных архей Methanosarcina barkeri Fusaro и Methanobrevibacter arboriphilus AZ. Для достижения поставленной цели решали следующие задачи: • выделение и очистка СОД из данных метаногенов и изучение молекулярных и кинетических свойств очищенных ферментов; • клонирование и секвенирование гена sod M. barkeri; • изучение влияния гемина на активность каталазы M. arboriphilus, не способного к синтезу гема; • выделение и очистка каталазы из M. arboriphilus и изучение молекулярных и кинетических свойств очищенной каталазы; • клонирование и секвенирование гена kat M. arboriphilus; • изучение аэротолерантности метаногенных архей M. barkeri Fusaro и M. arboriphilus AZ; • исследование регуляции каталазы и СОД у метаногенов.