ИСТИНА

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) химически нестабильна (в том числе в физиологических условиях), и результатом подобного феномена является образование десятков и даже сотен тысяч эндогенных повреждений ДНК на геном в сутки [Lindahl T., 1993]. В дополнение к этому действие многочисленных физических и химических факторов окружающей среды провоцирует образование экзогенных повреждений ДНК. Несмотря на неотъемлемую роль динамической природы ДНК в процессе эволюционной изменчивости, ее повреждения препятствуют нормальному протеканию жизненно важных процессов репликации генетического материала и транскрипции, приводя к нарушениям экспрессии генов и в ряде случаев гибели клеток. Повреждения ДНК также являются источником мутаций и, как следствие, нестабильности генома и ассоциированных патологических состояний, включающих нейродегенеративные и онкологические заболевания, а также старение клеток и организма в целом. Для поддержания целостности клеточного генома и предотвращения преждевременного старения и злокачественного перерождения клетки располагают широким набором защитных механизмов, включающих системы репарации ДНК. Функция последних заключается в устранении повреждений ДНК, а также коррекции мутаций, вызванных действием эндогенных и экзогенных мутагенов. Однако выполнение подобной функции не ограничивается лишь репарацией ДНК: для поддержания целостности генома необходима совокупность действия систем распознавания повреждений ДНК, передачи сигнала от поврежденной ДНК к различным белкам, обеспечивающим комплексный клеточный ответ на генотоксический стресс, включая ферменты репарации, и, наконец, непосредственно репарации ДНК. Необходимой частью подобной схемы регуляции являются также и системы уничтожения целых клеток в случае невозможности своевременной и качественной репарации их генетического материала с целью предотвращения злокачественного перерождения. Координированное действие вышеупомянутых систем иначе называется клеточным ответом на повреждения ДНК и является обязательным свойством нормальной (непатологической) клетки. Целью настоящей работы явились выявление и детальное исследование молекулярных механизмов клеточного ответа на нерепарированные ОР и белков, вовлеченных в их реализацию. В ходе исследования были поставлены и успешно решены следующие задачи: 1. Проверить возможность существования негативной регуляции уровня экспрессии Е3-убиквитинлигазы MULE, контролирующей содержание белков-эффекторов клеточного ответа на ОР опухолевого супрессора р53 и ДНК-полимеразы β (POL β), в зависимости от эффективного уровня повреждений ДНК в клетках. Установить биохимическую значимость и механизм подобной регуляции. 2. Выяснить механизм регуляции стационарного содержания Е3-убиквитинлигазы MULE, которая обеспечивает координацию репарации ОР с прогрессией клеточного цикла. 3. Выявить функциональную значимость неосновной изоформы убиквитин-специфической протеазы USP7 (USP7S) и изучить роль посттрансляционной модификации уникального для USP7S остатка серина 18 в регуляции стационарного уровня содержания фермента. 4. Провести биохимическую идентификацию белков, ответственных за фосфорилирование и дефосфорилирование остатка S18 в USP7S. 5. Исследовать возможность регуляции активности и/или стабильности, и/или комплексообразования с субстратом киназы и фосфатазы, ответственных за контроль статуса S18-фосфорилирования USP7S, в зависимости от количества нерепарированных ОР. Выяснить механизм подобной регуляции. 6. Идентифицировать белок-преобразователь, контролирующий клеточный сигнальный каскад в ответ на ОР, и выявить его биохимическую роль в координации прогрессии клеточного цикла и эффективности ОР-репарации. Выявить белок-сенсор, обеспечивающий детекцию нерепарированных ОР и передачу сигнала преобразователю. Исследовать функциональную взаимозависимость каскада сигнализации нерепарированных ОР с клеточными системами, реализуемыми в ответ на генотоксический стресс других типов (ДР и окислительный стресс). Основные результаты диссертационной работы были представлены к обсуждению мировым научным сообществом в виде устных и постерных докладов на росийских и международных конференциях: “56th Annual Meeting of the Radiation Research Society” (США, 2010), “Charles Rodolphe Brupbacher Symposium on Cancer Genome and DNA Repair” (Швейцария, 2011), “6th International Workshop on Mdm2” (США, 2011), “6th DNA repair workshop” (Словакия, 2012), “3rd Erling Seeberg Symposium on DNA Repair” (Норвегия, 2012), международная конференция “Биокатализ-2013: Фундаментальные основы и применение” (Россия, 2013), “Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society” (Великобритания, 2014), “5th US-EU International Conference on Repair of Endogenous DNA Damage” (США, 2014), “Tomas Lindahl Conference on DNA Repair” (Норвегия, 2015), “Benzon Symposium on Genome Instability and Neurodegeneration (no. 62)” (Копенгаген, 2016). Апробация диссертационной работы прошла 24 марта 2017 г. на заседании кафедры химической энзимологии Химического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 25 печатных работ: 15 статей (все в журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ) и 10 тезисов докладов международных конференций. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав (“Обзор литературы”, “Материалы и методы”, “Результаты” и “Обсуждение результатов”), заключения, выводов, списка сокращений и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 268 страницах, содержит 83 рисунка, 10 таблиц и 633 источника литературы.