ИСТИНА

Целью данной работы было cоздание ДНК/РНК аптамеров, изучение их структуры с помощью компьютерного моделирования, спектральных методов. Исследование процессов комплексообразования аптамеров с белками с использованием различных видов хроматографии, электрофорезов, поверхностного плазмонного резонанса, методов меченых атомов, Было поставлено две задачи: во-первых, исследовать структуру природных комплексов рибосомных белков S7, которые специфически связываются с РНК, и с помощью метода SELEX сконструировать РНК-аптамеры к термофильному белку, тем самым, отработав методические подходы. Во-вторых, используя метод SELEX, создать бинарные комплексы ДНК с ферментом тромбином, который не взаимодействует с нуклеиновой кислотой, изучить структуру полученных ДНК-аптамеров, ингибирующих активность фермента. Тромбин служит центральным звеном в реакциях свертывания крови. Его избыточная активность создает угрозу развития тромбозов. Рибосомный белок S7, ключевой белок сборки и функционирования малой субчастицы прокариотических рибосом, образует природные комплексы с двумя различными по структуре молекулами РНК. Он связывается с 16S рРНК и инициирует сборку малой субчастицы рибосомы 30S, а также связывается с межцистронным фрагментом (МЦФ) матричной РНК (мРНК) стрептомицинового оперона, регулируя свой собственный синтез. В работе были использованы два рибосомных белка из Escherichia coli (EcoS7) и Thermus thermophilus (TthS7). Термофильный белок TthS7 был выбран в качестве объекта, так как представляет собой природный мутант к белку EcoS7, а также в связи с отсутствием данных о регуляции синтеза данного белка в термофильных бактериях. Вторую задачу решали, используя тромбин, сериновую протеиназу, которая играет ключевую роль в процессе свертывания крови. Тромбин не имеет природных комплексов с нуклеиновой кислотой. Ранее с помощью метода SELEX был получен 15-звенный фрагмент ДНК (Bock, 1992), который ингибировал фибриноген-гидролизующую активность тромбина. С помощью компьютерного моделирования была предложена 31-звенная нуклеотидная последовательность, которая также влияла на активность тромбина (Ikebukuro, 2005). Надо подчеркнуть, что тромбин обладает как прокоагулянтными, так и антикоагулянтными свойствами. Эти активности тромбина не были изучены в присутствии аптамерных ДНК. Наша задача состояла в исследовании структуры новых аптамеров, а также в изучении ингибирующих функций ДНК-аптамеров. Тромбин взаимодействует не только с фибриногеном, но и с клеточными PAR рецепторами (“Protease Activated Receptors”) тромбоцитов, которые участвуют в процессе свертывания крови, поэтому планировали исследовать влияние аптамерных ДНК на агрегацию тромбоцитов, в которой участвуют PAR рецепторы.