![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
http://www.chem.msu.ru/rus/theses/2014/2014-07-09-panin/welcome.html Актуальность проблемы. Пенициллинацилаза из Escherichia coli (ecПА) широко используется в фармацевтической промышленности для получения ядер бета-лактамных антибиотиков путем гидролиза природных пенициллинов и цефалоспоринов. Проводится изучение биокатализатора в реакциях энантиоселективного ацилирования аминосоединений в водной среде при получении полусинтетических антибиотиков, разделении рацематов, пептидном синтезе с участием неприродных аминокислот, защите свободных аминогрупп и др. Однако ограниченная субстратная специфичность и стереоспецифичность фермента дикого типа, осложнение реакций синтеза протеканием побочных реакций гидролиза, низкая стабильность в щелочной среде и в присутствии высоких концентраций субстратов во многом ограничивают его более широкое применение. Перспективным путем решения проблемы является использование методов белковой инженерии для направленного изменения свойств фермента в зависимости от поставленной задачи. Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось обнаружение и характеристика мутаций, приводящих к изменению каталитических свойств и стабильности фермента. В связи с этим основными задачами были: • анализ и систематизация литературных и патентных данных для установления структурно-функциональных взаимосвязей и определения роли ранее проведенных аминокислотных замен, приводящих к изменению свойств фермента дикого типа; • определение стратегии и выбор аминокислотных остатков для мутагенеза; • получение, выделение и очистка новых мутантных форм фермента для последующей характеристики; • изучение каталитических свойств и стабильности полученных мутантов ecПА, их способности катализировать получение полусинтетических пенициллинов, а также стереоселективное ацилирование аминоспиртов в водной среде; • установление основных эффектов от введенных мутаций, нахождение закономерностей и корреляций, составление рекомендаций. Научная новизна работы. При выборе стратегии мутагенеза был использован комплексный подход, основанный на анализе последних представлений о структуре и механизме действия фермента, молекулярном моделировании и биоинформатике, что позволило выбрать ранее неизвестные позиции для изменения свойств фермента дикого типа. Получены двадцать семь новых активных мутантных форм ecПА. При систематическом изучении их каталитических свойств и стабильности показано, что направленный мутагенез позволяет существенно и целенаправленно изменять свойства фермента. Обнаружено, что введение мутации bF256R позволяет в 4 раза, а в комбинации с aR145G более чем в 20 раз увеличить эффективность ацилирования 6-аминопенициллановой кислоты в реакции синтеза бета-лактамных антибиотиков; введение мутации bF71A приводит к 250-кратному увеличению стереоселективности в реакции ацилирования ароматических аминоспиртов. Установлено, что солевая триада bR297-bE266-bN262 и карбоксил-карбоксилатная пара bE482-bD484 играют существенную роль в поддержании третичной структуры белка. Отталкивание однозарядной пары остатков bE482-bD484 определяет низкую стабильность ecПА дикого типа в щелочной среде. Обнаружена мутация bD484N, позволяющая сохранить взаимодействие между остатками в широком интервале рН, что приводит к 9-кратному увеличению стабильности в щелочной среде, а также в присутствии высоких концентраций субстратов при пептидном синтезе. Впервые показана возможность замены консервативного для пенициллинацилаз N-концевого нуклеофильного серина bS1 на треонин с сохранением каталитической активности путем введения компенсирующей мутации. Установлены прямые корреляции между активностью мутантных форм в реакциях гидролиза хромогенного субстрата и синтеза N-ацильных производных аминоспиртов, а также эффективностью ацилирования ароматических и алифатических аминоспиртов. Практическая значимость работы. Показано, что мутант bD484N не только более стабилен в щелочной среде, но и существенно более устойчив к инактивации при высоких концентрациях субстратов, что расширяет границы применимости фермента в препаративном пептидном синтезе. Препараты на основе мутации bF256R характеризуются более чем 4-кратным улучшением эффективности ацильного переноса, что может найти применение в препаративном биокаталитическом получении полусинтетических антибиотиков. Стереоселективность мутанта bF71A к S-фенилацетилфенилаланинолу превышает стереоселективность ecПА дикого типа более чем на 2 порядка, что позволяет провести биокаталитическое разделение рацемата аминоспирта и получить индивидуальные энантиомеры высокой оптической чистоты. Разработано программное обеспечение, позволяющее моделировать протекание биокаталитических реакций при варьировании начальных концентраций реагентов и эффективных кинетических параметров. Апробация работы. Основные положения и результаты работы были представленны на зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2014 г., Москва, ИБХ, лауреат I премии), международном конгрессе «FEBS-2013» (2013, Санкт-Петербург), международных конференциях «Protein Stabilization» (2014, Италия), «Enzyme Engineering XXII» (2013, Япония), «BioTrans-2013» (2013, Англия), «Biocatalysis-2013» (2013, Москва), «BioTrans-2011» (2011, Италия), российском симпозиуме «Белки и пептиды» (2011, Петрозаводск). Публикации. По материалам диссертации подготовлены и опубликованы 4 статьи в рецензируемых научных журналах, получен 1 патент, поданы 2 заявки на изобретение, представлены 11 тезисов докладов международных конференций. Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Литературный обзор», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Основные результаты и выводы», «Список литературы», «Приложения». Объем диссертации составляет 200 страниц машинописного текста (в том числе 20 страниц приложений) и включает 76 рисунков, 67 таблиц, 2 диаграммы, 5 схем и 151 библиографическую ссылку.