ИСТИНА

Работа посвящена актуальной проблеме биохимии и биофизики – выяснению молекулярного механизма преобразования энергии, осуществляемого в мембранных ферментах электрон-транспортных цепей митохондрий, бактерий и хлоропластов. В процессе дыхания энергия окислительно-восстановительных реакций превращается электрон-транспортной цепью митохондрий и многих бактерий в разность электрохимических потенциалов ионов водорода на сопрягающей мембране (H+). Возникающая таким образом протон-движущая сила служит в клетке в качестве источника энергии в реакциях биохимического синтеза, мембранного транспорта, механического движения бактериальных клеток и тд. В концевом участке дыхательных цепей аэробных организмов образование протон-движущей силы обеспечивается в результате работы терминальных оксидаз, катализирующих восстановление кислорода цитохромом c или хинолом. Основная подгруппа терминальных дыхательных оксидаз, включающая цитохромоксидазу (ЦО) из митохондрий, образует суперсемейство структурно-родственных гем-медных оксидаз. Отличительной особенностью представителей суперсемейства является каталитический центр, который образован близко расположенными ионом железа гемовой группой и ионом меди (т.н. биядерный или бинуклеарный центр, BNC) и в котором непосредственно происходит восстановление молекулы кислорода с образованием двух молекул воды. В ходе каталитического цикла, сопряженно с химической реакцией, ЦО образует H+ в результате двух процессов. Во-первых, электроны поступают в BNC ЦО от цитохрома с с внешней стороны мембраны (P-сторона), в то время как участвующие в восстановлении кислорода и образовании молекул воды протоны (т.н. “субстратные” или “химические”) переносятся электрогенно в BNC из внутренней водной фазы (N-сторона). Во-вторых, цитохромоксидаза является редокс-зависимым протонным насосом и дополнительно переносит с N-стороны на P-сторону мембраны в среднем четыре протона (т.н. “помпируемые” протоны) на каждую восстановленную молекулу кислорода. Таким образом, ЦО представляет собой сложную и уникальную в своем роде молекулярную машину, осуществляющую сопряжение одноэлектронного окисления цитохрома с, 4-х электронного восстановления и протонирования молеулы кислорода с образованием воды и редокс-зависимого направленного трансмембранного переноса протонов. Сочетание этих процессов требует сложной организации и точной взаимной артикуляции перемещения зарядов (электронов и протонов) и превращения молекулы кислорода в ходе каталитического цикла. Выяснение молекулярного механизма редокс-сопряженного разделения зарядов в ЦО, динамики и траекторий внутрибелкового переноса протонов является одними из наиболее важных и сложных задач биэнергетики, а также необходимой предпосылкой для установления общих закономерностей механизма образования трансмембранного потенциала ферментами энерго-сопрягающих мембран. В последние годы для ряда цитохромоксидаз была получена трехмерная кристаллическая структура с атомным разрешением, что в сочетании с возможностями направленного мутагенеза и кинетических методов с временным разрешением предоставляет уникальную возможность выяснения деталей механизма сопряжения энергии и внутрибелкового переноса протонов в данном ферментном комплексе. Целью работы являлось изучение молекулярного механизма сопряженного трансмембранного переноса зарядов (электронов и протонов) в цитохромоксидазе. В суперсемействе гем-медных дыхательных оксидаз выделяются 3 семейства A-, B- и C-типа, отличающиеся в первую очередь структурой протон-проводящих путей. Семейство А образовано наиболее представительной группой ферментов, включающей цитохромоксидазу из митохондрий сердечной мышцы быка, аа3 оксидазы из Paracoccus denitrificans и Rhodobacter sphaeroides, а также хинол-оксидазу bo-типа из Escherichia coli. ЦО из митохондрий содержит четыре редокс-центра. CuA располагается вблизи места взаимодействия ЦО с цитохромом с на внешней (P) стороне мембраны. Низко-спиновый гем а и биядерный каталитический центр, состоящий из высоко-спинового железа гема a3 и иона меди (CuB), погружены в гидрофобное ядро белка и располагаются на сходном расстоянии от поверхности мембраны, ближе к внешней стороне. Каталитический цикл ЦО состоит из двух частей: восстановительной и окислительной. Восстановительная часть включает в себя перенос от цитохрома с в окисленный биядерный центр ЦО (состояние О) 1-го и 2-го электрона с образованием состояния R. В окислительной фазе молекула кислорода связывается с восстановленным двумя электронами BNC, после чего молекула O2 расщепляется и принимает суммарно 4 электрона от гема а3, CuB и входящего в состав активного каталитического центра ЦО остатка тирозина Y288, расположенного в вблизи двухядерного центра и образующего ковалентную связь со связанным с CuB остатком гистидина. Возникшие 2 электронные вакансии в каталитическом центре ЦО заполняются переносом 3-го и 4-го электронов, переводя ЦО последовательно из состояние P в F и из F в окисленное состояние (O). Одноэлектронные переходы биядерного центра ЦО сопряжены с набором частных реакций переноса электрона между редокс-центрами фермента и транслокации протонов в нем, происходящих в недоступном для быстрого смешивания временном диапазоне и потому практически неизученных с временным разрешением. В связи с этим, ставилась задача описать механику векторного переноса зарядов в цитохромоксидазе, разрешив во времени отдельные стадии электрогенного переноса электронов и протонов, составляющие суть отдельных одноэлектронных переходов в каталитическом цикле. Выяснить точную стехиометрию переноса помпируемых протонов в отдельных одноэлектронных переходах каталитического цикла цитохромоксидаз. Требовалось установить сопряженные электрон-транспортные стадии и конформационные изменения, контролирующие отдельные стадии транслокации протонов. Выявить внешние факторы, способные влиять на динамику проведения протонов в ЦО. Ставилась задача выяснить роль протон-проводящих путей в отдельных одноэлектронных переходах в каталитическом цикле ЦО. Локализовать траектории проведения протонов в цитохромоксидазе и выявить взаимную артикуляции частных электрон и протон-транспортных реакций внутри отдельного одноэлектронного перехода фермента. Выяснить точную структуру каталитических интермедиатов ЦО, включая промежуточную локализацию протонов в кислород-редуктазном центре и в его окрестности. Выяснить структурно-функциональные особенности неканонических цитохромокосидаз семейства B по сравнению с ЦО семейства А, обусловливающие естественно сниженную эффективность трансмембранной перекачки протонов, наблюдаемую в стационарных измерениях. Научная новизна работы заключается в следующем. Показано, что использование фотоактивируемого комплекса трис(бипиридил)рутения (Rubpy) (свободной формы и ковалентно присоединенного к цитохрому с) позволяет в предстационарном режиме с микросекундным разрешением исследовать отдельные стадии транслокации электрона и протонов, сопряженные с переносом 1-го, 3-го и 4-го электронов в каталитическом цикле ЦО из митохондрий. Впервые показано, что P-F и F-O переходы сопряжены с электрогенным переносом эквивалентного количества протонов через мембрану. Фотоиндуцированные переходы O-E, P-F и F-O митохондриальной ЦО сопровождаются микросекундной (“быстрой”) нечувствительной к цианиду электрогенной фазой с ~40-50 мкс, соответствующей электрогенному восстановлению гема а входной медью (CuA). Переход P-F и F-O митохондриальной ЦО включает также две миллисекундные (“средняя” и “медленная”) компоненты генерации мембранного потенциала. В отличие от “быстрой”, миллисекундные компоненты характеризуется в ~5-6 раз более высокими значениями энергии активации, чувствительны к цианиду и отражают электрогенный перенос протонов, сопряженный с реокислением гема а биядерным центром фермента. Суммарная амплитуда электрогенного перемещения протонов в P→F и F→O переходах ЦО (3-й и 4-й электроны в каталитическом цикле ЦО, соответственно) в ~4 раза больше амплитуды электрогенной фазы переноса электрона с внешней стороны мембраны к гему а. Впервые показано, что перенос электрона от гема а в биядерный центр в переходах P→F и F→O цитохромоксидазы из митохондрий, фотоиндуцированных Rubpy, характеризуется значением 0.3 мс и 1.5 мс, соответственно. Синхронно с редокс-реакцией ЦО образует трансмембранную разность потенциалов, соответствующую около половины суммарной величины электрогенного перемещения протонов, в то время как другая часть электрогенного переноса протонов ферментом происходит позднее в “медленной” электрогенной фазе (1.8 мс и 4.5 мс, соответсвенно) засчет сохраненной свободной энергии редокс-реакции в промежуточном напряженном конформационном состоянии митохондриальной ЦО. Впервые разрешена кинетика генерации мембранного потенциала ферментом дикого типа и рядом мутантных форм прокариотической цитохромоксидазы аа3 –типа из R.sphaeroides, относящейся как и ЦО из митохондрий к семейству А гем-медного суперсемейства терминальных оксидаз. Показано, что компоненты электрогенного движения протонов (“средняя” и “медленная” электрогенные фазы), сопряженные с реокислением гема а в переходе F→O ЦО из R.sphaeroides, характеризуются близким соотношением наблюдаемых относительных амплитуд и скоростей к таковому в гомологичной митохондриальной ЦО. Показано, что электрогенная транслокация протонов в ходе каталитического цикла цитохромоксидазы аа3-типа из внутренней водной фазы на внешнюю сторону мембраны и в биядерный каталитический центр происходит через протон-проводящие D и К каналы, содержащие критически важные консервативные протон-обменивающие группы. Доказана роль ряда консервативных остатков в этих каналах и локализованы участки траектории проведения протонов в ходе каталитического цикла ЦО. Впервые показано, что протонный D-канал обслуживает перенос помпируемых протонов, а также перенос субстратных протонов в окислительной полуреакции каталитического цикла (стадии P→F, F→O), в то время как K-канал участвует в переносе субстратных протонов в восстановительной полуреакции (перенос первых двух электронов в BNC). Впервые изучена предстационарная кинетика генерации мембранного потенциала несопряженной мутантной формой ЦО с заменой N139D в D-канале, характеризующейся полностью сохраненной кислород-редуктазной активностью и ингибированием способности к трансмембранному проведению протонов в стационарных условиях. Показано, что F→O переход ЦО c N139D сопряжен с переносом через мембрану одного элементарного заряда, включая перенос электрона и субстратного протона с противоположных сторон мембраны в BNC на расстояние соответственно ~0.38 и ~0.62 толщины мембранного диэлектрика. Дополнительный вклад электрогенного переноса протонов в ЦО дикого типа из R. sphaeroides и митохондрий соответствует трансмембранному переносу не более одного (~0.9) помпируемого протон в каждом из переходов P→F и F→O окислительной фазы каталитического цикла. Исходя из полученных результатов и данных других авторов, сделано заключение о том, что общая стехиометрия переноса протонов на отдельных стадиях каталитического цикла митохондриальной ЦО соответствует переносу 1 помпируемого протона. Впервые показано, что электрогенное расстояние от внутренного донора протонов E286 до BNC составляет ~0.15 диэлектрической толщины мембраны. Исходя из сравнения кинетического изотопного эффекта замены D2O/H2O в ЦО дикого типа и мутанта N139D, показано, что “средняя” электрогенная фаза ассоциирована с переносом помпируемого протона через внутренний донор протонов к внешней стороне мембраны, в то время как “медленная” электрогенная фаза связана с переносом субстратного протона из внутренней водной фазы к BNC. То есть, электрогенное перемещение помпируемого протона в механизме сопряженного протонного транспорта в ЦО предшествует электрогенному перемещению субстратного протона по направлению к биядерному центра. Впервые показано, что ионы цинка, добавленные к протеолипосомам с ЦО с внешней стороны мембраны ингибируют “медленную” электрогенную фазу переносу протона, что указывает на высвобождение помпируемого протона на внешнюю сторону мембраны в “медленной” электрогенной фазе. Предложен механизм помпирования в отдельных одноэлектронных переходах окислительной фазы каталитического цикла ЦО, включающий две кинетически разрешаемые стадии электрогенной транслокации протонов, сопряженные с переносом электрона от гема а в BNC. Первая стадия включает в себя перенос помпируемого протона к промежуточному акцептору протона вблизи внешней поверхности мембраны через консервативный остаткок глутамат в верхней части D-канала (E286), располагающийся вблизи биядерного центра. Во второй стадии происходит высвобождение помпируемого протона из промежуточного акцептора протона на внешнюю сторону мембраны, синхронно с электрогенным перемещением субстратного протона из внутренней водной фазы в область биядерного центра фермента. Впервые разрешена быстрая кинетика генерации мембранного потенциала ЦО bа3 типа из T. thermophilus (подсемейства B) при одноэлектронном восстановлении окисленной формы фермента. Показано, что неактивный “закрытый” в реакции связывания внешних лигандов активный центр фермента переходит в активную форму при восстановлении гема b. Впервые разрешены интермедиаты каталитического цикла ЦО ba3 из T. thermophilus в быстрой реакции с кислородом в режиме одного оборота фермента. Сравнение соответствующих интермедиатов каталитического цикла в разрешенной кинетике ЦО bа3 типа из T. thermophilus и классических ЦО аа3 типа позволило выяснить локализацию протона и способствовало установлению точной структуры интермедиата F каталитического цикла ЦО и конечного акцептора субстратного протона в переходе PF. Показано, что перенос протона из внутренней водной фазы в каталитический BNC цитохромоксидазы, сопряженный с P-F переходом, происходит к двум конечным акцепторам протона: в случае цитохромоксидазы аа3 типа на связанный с CuB гидроксил-анион, а в случае ba3 оксидазы - на ковалентно-связанный с лигандом CuB остаток тирозина. Показано, что причиной сниженной эффективности протонного насоса ba3 цитохромоксидазы из T. thermophilus в стационарных измерениях является отсутствие трансмембранного переноса протона на стадии P-F перехода фермента (стадия присоединения к кислороду 3-го электрона) и O-E (стадия присоединения к кислороду 3-го и 1-го электронов, соответсвенно). Практическая значимость исследования заключается в следующем. Полученные результаты значительно расширяют современные знания о свойствах и функционировании цитохромоксидазы и могут оказаться полезными при изучении других протон-транспортирующих белков. В частности, важно выяснение механизма внутрибелкового проведения протонов в ЦО для понимания работы белковых ионных насосов. Детальный анализ восстановления кислорода в ЦО и его связь с механизмом работы пероксидаз дают ценную информацию о ферментативном превращении кислорода, необходимую для расшифровки путей регуляции кислородного метаболизма в клетке и для создания кислородных биосенсоров. Материалы работы используются в учебном процессе на факультет Биоинженерии и Биоинформатики и на Биологическом факультете МГУ. Результаты исследований вошли в курс лекций по биоэнергетике. Материалы работы были представлены и обсуждались на 9-ой, 12-ой, 14-ой, 15-ой и 16-й Европейских Биоэнергетических конференциях – EBEC (Лувен-ла-Нев, 1996; Аркашон, 2002; Москва, 2006; Дублин, 2008; Варшава, 2010), на 2-ом и 7-ом Европейском Биофизическом конгрессе (Орлеан, 1997; Генуя, 2009), на 26-м съезде Федерации Европейских биохимических обществ – FEBS (Ницца, 1999), 18-м конгрессе Международного союза биохимиков и молекулярных биологов – IUBMB (Бирмингем, 2000), Европейской конференции по спектоскопии биологических молекул ECSBM (Сегед, 2003), конференция “Российская биоэнергетика: от молекул к клетке” (Москва, 2005), на 8-й Европейской конференции по Биологической химии Eurobic 8 (Авиеро, Португалия, 2006), на V съезде Российского фотобиологического общества Международная конференция “Преобразование энергии света при фотосинтезе” (Пущино, 2008), а также на ряде Гордоновских конференциях по биоэнергетике. Работа была также апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ. Результаты, представленные в работе, удостоены Государственной Премии Российской Федерации за выдающиеся работы в области науки и техники для молодых ученых, премии Европейской академии для молодых ученых СНГ, премии им А.Д.Каулена за лучшую работу молодых ученых МГУ НИИФХБ, премии Биохимического общества при Российской Академии Наук для молодых ученых России. По материалам исследований опубликовано 15 статей в рецензируемых журналах и 15 тезисов конференций. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литература, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 180 страниц, 55 рисунков, 3 таблицы. В работе использовано 240 литературных источников.