ИСТИНА

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к штаммам микроорганизмов. Реликтовый микроорганизм - штамм Bacillus sp. ВКПМ В-10130 выделен из многолетнемерзлых пород и способствует увеличению мышечной силы, физической и умственной активности, а также обладает иммуномодулирующей и геропротекторной активностью.Изобретение относится к биотехнологии, в частности к штаммам микроорганизмов, и может быть использовано для стимулирования деятельности иммунной системы и увеличения продолжительности жизни животных и человека. В условиях, когда фундаментальные механизмы старения по-прежнему представляют собой актуальную проблему, изучение клеток, способных выживать в течение тысячелетий, вполне может представлять интерес для геронтологии. Свидетельства жизнеспособности микроорганизмов в мерзлоте появились еще в девятнадцатом столетии. С.С.Абызов в 1979 году обнаружил во льду на Антарктической станции Восток бактерии, грибы, диатомеи и другие микроорганизмы (Абызов С.С., Бобин Н.Е., Кудряшов Б.Б., 1979. Микробиологические исследования ледника в Центральной Антарктиде. Известия АН СССР, серия Биология, 6, с.828-836). Не отрицая вероятности развития микроорганизмов в мерзлых породах, отметим, что их рост, вероятно, затруднен. Даже в лабораторных условиях стареющие культуры, как известно, прекращают расти. Кристаллизация воды и остановка внешнего обмена веществ уменьшает способность к росту. Поэтому можно считать, что бактерии в многолетнемерзлых породах представляют собой ископаемые, реликтовые организмы. Их возраст подтверждается геологическими условия местонахождения (Баранова Ю.П., Ильинская И.А., Никитин В.П., Пнева Г.Н., Фрадкина А.Ф., Шварева Н.Я. Миоцен Мамонтовой горы. Труды ГИН СО АН СССР. Наука. Москва. 1976. 284 с.), радиоуглеродными датировками (Katayama Т., Tanaka M., Moriizumi J., Nakamura Т., Brouchkov A., Douglas T.A., Fukuda M., Tomita F., Asano K. Phylogenetic Analysis of Bacteria Preserved in a Permafrost Ice Wedge for 25,000 Years. Appl. Environ. MicrobioL, Apr. 2007: 2360-2363), изучением оптических изомеров аминокислот (Brinton K.L.F., Tsapin A.I., Gilichinsky D., McDon-ald G.D. Aspartic Acid Racemization and Age-Depth Relationships for Organic Carbon in Siberian Permafrost. Astrobiology, Volume 2, Number 1, 2002, p.77-82), косвенно, биоразнообразием встречаемых видов (Friedmann El. 1994. Permafrost as microbial habitat. In Viable Microorganisms in Permafrost. Russian Academy of Sciences: Pushchino, Russia; 21-26). Природа длительной жизнеспособности микроорганизмов в древней мерзлоте не имеет исчерпывающего объяснения. Способность реликтовых микроорганизмов сохранять жизнеспособность длительное время предполагает существование механизма, предотвращающего накопление повреждений. Мы считаем возможным использование этого механизма для лечения болезней и продления жизни животных и человека. Настоящее изобретение относится к бактериям рода Bacillus, найденным в древних многолетнемерзлых породах Якутии. Известен штамм бактерий Bacillus subtilis 1719, выделенный в естественных условиях и проявляющий широкий спектр антагонистической активности, низкую адгезивную активность и иммуномодулирующую активность (патент RU 2298032 С2, опубликовано 27.10.2007). Известен штамм бактерий Bacillus macroides Excel 00, выделенный из мицелия лекарственного гриба Agaricus Blazei Murill, проявляющий иммунную активность и способность препятствовать старению и болезням (заявка JP 2008-005702 А, опубликовано 17.01.2008). Патентуемый штамм Bacillus sp. M3, в отличие от известных, выделен из вечной мерзлоты, возраст которой составляет многие тысячи лет, и поэтому характеризуется исключительной жизнеспособностью и способностью выживать в течение длительного времени при низких температурах. В экспериментах с его культурой наблюдается увеличение мышечной силы, увеличение физической и умственной активности, иммуномодулирование и замедление старения. Указанный технический результат достигается микроорганизмом - штаммом Bacillus sp. M3, выделенным из многолетнемерзлых пород и обладающим иммуномодулирующей и геропротекторной активностью. Штамм Bacillus sp.M3 задепонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУПГосНИИГенетика 30.01.2009, регистрационный номер ВКПМ: В-10130. 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Для получения микроорганизмов из мерзлых пород были отобраны образцы из естественных обнажений. Они расположены на левом берегу Алдана, в 325 километрах вверх по течению от его впадения в Лену, на Мамонтовой горе. Образцы были отобраны в 0.9-1 м глубже слоя сезонного оттаивания. Обнажение разрушается рекой (более метра в год), так что отложения, из которых отбирались образцы, находились, очевидно, в многолетнемерзлом состоянии. При этом происходит ежегодное весенние смывание обрушений, предотвращающее завалы и смешения пород. Последние представляют собой тонкозернистые пески и алевролиты; их возраст соответствует среднему миоцену (Баранова Ю.П., Ильинская И.А., Никитин В.П., Пнева Г.Н., Фрадкина А.Ф., Шварева Н.Я. Миоцен Мамонтовой горы. Труды ГИН СО АН СССР. Наука. Москва. 1976. 284 с.). Похолодание началось здесь в конце плиоцена, около 3-3.5 миллионов лет тому назад. Температура в январе для того времени была оценена от -12 до -32°С, а в июле от +12 до +16°С. Отложения, по-видимому, не оттаивали в плейстоцене из-за холодного климата Якутии. Таким образом, возраст мерзлоты на Мамонтовой горе, вероятно, может достигать 3.5 миллионов лет. Кроме того, были отобраны образцы из повторно-жильных льдов ледяного комплекса в Якутии и на Аляске: в тоннеле Фокс и на золотом руднике вблизи Фербенкса, а также из стенок подземелья Института Мерзлотоведения им. П.И.Мельникова в Якутске. 1.1. Отбор образцов Пробы отбирались с использованием стерилизованных спиртом и обожженных в пламени металлических инструментов (буры, пинцеты, скальпели). Для того чтобы провести поверхностную стерилизацию образцов, проба весом около 50 г помещалась в стакан с 96% раствором этанола на одну минуту и затем в пламя горелки на примерно 2 сек и, наконец, в стерильную пробирку. Отобранные породы хранились при температуре -5°С, что было близко к естественным условиям. Транспортировка проб осуществлялась в термоконтейнерах с хладагентами в мерзлом состоянии. 1.2. Рост на искусственных средах Образцы различного разведения в стерильных условиях добавлялись в чашки Петри, содержащие среды YPD, MRS и NA (см инструкцию Manual of environmental microbiology. 1997. Ed. Hurst C.J. FSM Press. Washington DC. 894 p.). Образцы добавлялись также в жидкий мясопептонный бульон в анаэробных и аэробных условиях. 1.3. Получение и секвенирование ДНК Рибосомальная ДНК микробной культуры извлекалась с помощью Fast DNA kit for soil (BIO 101 Inc., Vista, CA), где применяется метод, основанный на разрушении клетки стеклянными шариками. Нуклеиновые кислоты осаждались из раствора с использованием раствора, состоящего из 0.1 части 3 М ацетата натрия (рН 5.2) и 2.5 частей этанола, инкубировались на льду, а затем центрифугировались в течение 30 минут на скорости 12000 об/мин. Осажденные нуклеиновые кислоты растворялись затем в дистиллированной воде (свободной от RN-аз и DN-аз) и хранились при -20°С. Фрагменты 16S rRNA были амплифицированы ПЦР, проводимой с бактериальными прай-мерами (27F; 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 1492R; 5'-TGACTGACTGAGGYTACCTTGTTACGACTT-3'). ПЦР проводилась в объеме 20-µ1 с помощью GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) следующим образом: 4 мин при 94°С, затем 30 циклов по 1 мин при 94°С, 1 мин при 50°С и 1.5 мин при 72°С, затем 7 мин при 72°С. ПЦР ампликоны подвергались электрофорезу и очищению с помощью Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, USA). Очищенные ампликоны были клонированы с использованием pCR2.1 вектора, культуры Е. coli, а также ТА cloning kit (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя. Из суточной культуры ДНК плазмид, содержащая 16S rDNA, получена с помощью Mini prep spin kit (Quiagen, Crawley, UK). Очищенные ДНК плазмид секвенировали на ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer с помощью Big Dye Terminator cycle-sequencing kit (Applied Biosystems). Амплицицированные продукты 27F-1492R были секвенированы в обоих направлениях с праймерами 27F, 357F (5'-CTACGGGAGGCAGCAG-3'), 520R (5'-ACCGCGGGGTGCTGGC-3'), 920F (5'-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3'), 1080R (5'-CCCAACATCTCACGAC-3') и 1492R как описано Mori et al. (1997). Длина последовательности составила 1488 bp. Полученная последовательность сравнивалась с другими, используя BLAST (Altschul et al., 1997). Филогенетическое дерево строилось по методу Saitou и Net (1987), используя CLUSTAL W software package (Thompson et al., 1994). Нуклеотидная последовательность 16S rRNA была депонирована в DDBJ/EMBL/GeneBank под номером AB178889, идентификационный номер 20040510203204.24251. 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ВЫДЕЛЕНИЯ, ИЗУЧЕНИЯ РОСТА И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ В мерзлых миоценовых отложениях на Мамонтовой горе было обнаружена культивируемая бактерия, способная к аэробному и анаэробному росту в средах YPD, MRS и NA; оптимальная температура роста определена в +37°С. Микроорганизм является психротолерантным, т.к. способен к метаболической активности при -5°С. Бацилла представляет собой сравнительно большую ((1-1.5)×(3-6) микрон) палочку, которая в культуре соединяется в цепи и способна образовывать споры круглой формы. Она неподвижна и обладает гемолитической активностью, грамположительна. Микроорганизм принадлежит роду Bacillus, но, по-видимому, является новым видом. Наибольшее видовое подобие выделенной бациллы отмечено с Bacillus macroides, гомология с 16S rRNA которого составляет 97%. Выживание и рост бацилл при низких температурах наблюдались ранее; известно, например, что Bacillus anthracis легко переносит замораживание (Luyet B.J., Gehenio P.M. 1940. Life and death at low temperatures. Biodynamica: Normany, Missouri; 99 p., a также Baross J.A., Morita R.Y. Life at Low Temperatures: Ecological Aspects. In Microbial Life in Extreme Environments, Kushner DJ (ed.). Academic Press: London 1978; 9-71). Однако оптимальная температура роста найденной бациллы довольно высока. Несмотря на то, что она оказалась способной на искусственной среде расти и ниже нуля, видимых колоний на мерзлых образцах при этом не наблюдалось. Насколько активна ее жизнь в мерзлоте, неясно; это относится и к микроорганизмам, выделенным из льдов Центральной Якутии и Аляски (Katayama Т., Tanaka M., Moriizumi J., Nakamura Т., Brouchkov A., Douglas T.A., Fukuda M., Tomita P., Asano K. Phylogenetic Analysis of Bacteria Preserved in a Permafrost Ice Wedge for 25,000 Years. Appl. Environ. MicrobioL, Apr. 2007: 2360-2363). Штамм Bacillus sp.ВКПМ В-10130 характеризуется следующими признаками. Культурально-морфологические особенности штамма: Морфологические: прямые палочки с закругленными концами, слабоподвижные 1-1,2×3-10 мкм, по 1-2, цепочки до 7. Образует эндоспоры овальной формы, расположенные центрально и терминально, не превышающие размер вегететивных клеток. Грамположительные. Культуральные: Оптимальные условия (температура +30-37°С, аэробные условия): однако способен расти и при температурах от 10°С и до 40°С и широком разбросе значений рН. На плотных агаризованных питательных средах образуют полиморфные, непрозрачные, блестящие, слегка шероховатые, мягкие колонии слабожелтоватого оттенка, с волнистым краем. Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СНА, МПА, МПБ). Для культивирования Bacillus sp. ВКПМ В-10130 применяют среду следующего состава, г/л: пептон 10, дрожжевой экстракт 5; вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 37°С и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста. Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70°С или в лиофильно-высушенном состоянии. Физиологические признаки. Не обладает гемолитической активностью, не подавляет рост типовых штаммов Bacillus cereus, Escherichia coli, Candida albicans, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, каталазоположителен, растет при концентрации NaCl до 5%, но не на 10%, устойчив к рифампицину, оксациллину, полимиксину, цефтазидиму, цефепиму; чуствителен к стрептомицину, бензилпенициллину, канамицину, гентамицину, амикоцину, эритромицину, меропенему, ампициллину, тетрациклину, левомицитину при 37°С, а при 10°С даже минимальная концентрация антибиотиков препятствует росту бактерии.