ИСТИНА

Настоящее изобретение относится в целом к новому белку, обладающему активностью нуклеазы, вариантам его применения и содержащим его средствам, в частности, к ферменту нуклеазе Cpf1 из бактерии Ruminococcus bromii. Настоящее изобретение также относится к фрагменту ДНК, кодирующему указанный фермент, вектору, содержащему указанную молекулу ДНК, системе CRISPR/Cpf1, содержащей указанную нуклеазу, клетке-хозяину для получения нуклеазы Cpf1, способу получения нуклеазы Cpf1, применению указанной нуклеазы Cpf1 для образования двунитевого разрыва в молекуле ДНК или РНК, способу образования двунитевого разрыва в молекуле ДНК или РНК с использованием указанной нуклеазы, системе доставки, содержащей указанную нуклеазу Cpf1, молекулу ДНК или вектор, композиции, содержащей указанную нуклеазу Cpf1, молекулу ДНК или вектор, способу модификации целевого локуса ДНК или РНК с использованием указанной нуклеазы, применению указанной нуклеазы Cpf1 для редактирования генома или генной терапии. В частности, в качестве средств для решения задачи настоящего изобретения предложены, обладающий активностью нуклеазы, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или фрагменту аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и кодирующая такой белок молекула ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную SEQ ID NO: 2. Их применение позволяет повышать универсальность доступных систем CRISPR-Cas, использовать нуклеазу RbCpf1 для разрезания геномной или плазмидной ДНК в большем количестве специфических сайтов и специфических условий. В частности, в различных вариантах осуществления настоящее изобретение включает следующие аспекты. Первым объектом настоящего изобретения является белок, обладающий активностью нуклеазы, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; или фрагмент аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 1. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 1. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 1. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 1. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 1. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 1. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 1. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 1. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 1. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 1. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок представляет собой природный белок. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок представляет собой выделенный белок. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок представляет собой искусственно синтезированный белок. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок представляет собой искусственно рекомбинантный белок. Возможен вариант осуществления, согласно которому белок представляет собой искусственно гибридный белок. Вторым объектом настоящего изобретения является молекула ДНК, кодирующая белок. Возможен вариант осуществления, согласно которому молекула ДНК содержит нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную SEQ ID NO: 2. Возможен вариант осуществления, согласно которому молекула ДНК содержит нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 2. Возможен вариант осуществления, согласно которому молекула ДНК содержит нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 2. Возможен вариант осуществления, согласно которому молекула ДНК содержит нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 2. Возможен вариант осуществления, согласно которому молекула ДНК содержит нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 98% идентичную SEQ ID NO: 2. Возможен вариант осуществления, согласно которому молекула ДНК содержит нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 2. Возможен вариант осуществления, согласно которому молекула ДНК содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2. Возможен вариант осуществления, согласно которому молекула ДНК состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2. Третьим объектом настоящего изобретения является вектор, содержащий нуклеиновую кислоту согласно второму объекту настоящего изобретения. Возможен вариант осуществления, согласно которому вектор является экспрессионным вектором. Четвертым объектом настоящего изобретения является клетка-хозяин для продуцирования белка согласно первому объекту настоящего изобретения, содержащая нуклеиновую кислоту или вектор согласно второму или третьему объектам настоящего изобретения соответственно. Возможен вариант осуществления, согласно которому клетка-хозяин представляет собой прокариотическую или эукариотическую клетку. Возможен вариант осуществления, согласно которому клетка-хозяин представляет собой клетку бактерии, гриба, растения или животного, в частности, насекомого или млекопитающего. Возможен вариант осуществления, согласно которому клетка-хозяин представляет собой E. coli. Пятым объектом настоящего изобретения является способ получения белка согласно первому объекту настоящего изобретения, включающий этапы культивирования клетки-хозяина согласно четвертому объекту настоящего изобретения в культуральной среде в условиях, подходящих для продуцирования белка. Возможен вариант осуществления, согласно которому способ дополнительно включает этапы выделения и/или очистки продуцированного белка. Шестым объектом настоящего изобретения является система CRISPR/Cpf1, содержащая белок согласно первому объекту настоящего изобретения. Седьмым объектом настоящего изобретения является применение белка согласно первому объекту настоящего изобретения для образования разрыва в молекуле нуклеиновой кислоты. Возможен вариант осуществления, согласно которому разрыв представляет собой однонитевой разрыв или двунитевой разрыв. Возможен вариант осуществления, согласно которому молекула нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК или РНК. Возможен вариант осуществления, согласно которому разрыв вносится в молекулу ДНК в положении, расположенном непосредственно перед нуклеотидной последовательностью 5'-YY(C/T)N-3' в указанной молекуле ДНК, или перед нуклеотидной последовательностью содержащей5'-YY(C/T)N-3' в указанной молекуле ДНК. Восьмым объектом настоящего изобретения является способ внесения разрыва в молекулу нуклеиновой кислоты, включающий приведение молекулы нуклеиновой кислоты с белком согласно первому объекту настоящего изобретения или молекулы ДНК согласно второму объекту настоящего изобретения. Возможен вариант осуществления, согласно которому способ осуществляют in vitro. Возможен вариант осуществления, согласно которому способ осуществляют in vivo. Возможен вариант осуществления, согласно которому молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу ДНК. Возможен вариант осуществления, согласно которому молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу ДНК. Возможен вариант осуществления, согласно которому разрыв представляет собой однонитевой разрыв. Возможен вариант осуществления, согласно которому разрыв представляет собой двунитевой разрыв. Возможен вариант осуществления, согласно которому контакт молекулы нуклеиновой кислоты с белком согласно первому объекту настоящего изобретения осуществляют путем введения указанного белка в клетку. Возможен вариант осуществления, согласно которому клетка представляет собой эукариотическую или прокариотическую клетку, в частности, клетку бактерии, растения, гриба или животного, например, млекопитающего, в частности, человека. Девятым объектом настоящего изобретения является способ образования двунитевого разрыва в последовательности геномной ДНК одноклеточного или многоклеточного организма, непосредственно примыкающей к последовательности 5'-YYN-3', или последовательности, содержащей 5'-YYN-3', включающий введение в по меньшей мере одну клетку этого организма эффективного количества: а) белка согласно первому объекту настоящего изобретения, или молекулы ДНК согласно второму объекту изобретения, и б) направляющей РНК, содержащей последовательность, образующую дуплекс с нуклеотидной последовательностью участка геномной ДНК организма, непосредственно примыкающей к нуклеотидной последовательности 5'-YYN-3' или последовательности, содержащей 5'-YYN-3', и взаимодействующей с указанным белком после образования дуплекса, или последовательности ДНК, кодирующей указанную направляющую РНК. Десятым объектом настоящего изобретения является система доставки, содержащая белок, молекулу ДНК или вектор согласно первому объекту настоящего изобретения. Одиннадцатым объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая нуклеазу Cpf1, молекулу ДНК или вектор согласно первому и/или второму объектам настоящего изобретения. Двенадцатым объектом настоящего изобретения является способ модификации целевого локуса нуклеиновой кислоты, включающий доставку к указанному локусу белка, молекулы ДНК или вектора согласно первому и/или второму объектам настоящего изобретения и подходящей направляющей РНК или системы согласно шестому объекту настоящего изобретения. Тринадцатым объектом настоящего изобретения является применение белка, молекулы ДНК или вектора согласно первому и/или второму объектам настоящего изобретения для редактирования генома. Возможен вариант осуществления, согласно которому редактируют геном одноклеточного или многоклеточного организма. Возможен вариант осуществления, согласно которому организм представляет собой прокариотический или эукариотический организм, в частности, относится к простейшим, бактериям, растениям, грибам, животным, в частности, представляет собой млекопитающее, такое как человек. Возможен вариант осуществления, согласно которому применение осуществляют для коррекции генетического дефекта в организме, в частности, в терапевтических целях. Четырнадцатым объектом настоящего изобретения является белок, молекула ДНК или вектор согласно первому и/или второму объектам настоящего изобретения для применения для редактирования генома. Возможен вариант осуществления, согласно которому редактируют геном одноклеточного или многоклеточного организма. Возможен вариант осуществления, согласно которому организм представляет собой прокариотический или эукариотический организм, в частности, относится к простейшим, бактериям, растениям, грибам, животным, в частности, представляет собой млекопитающее, такое как человек. Возможен вариант осуществления, согласно которому применение осуществляют для коррекции генетического дефекта в организме, в частности, в терапевтических целях. Пятнадцатым объектом настоящего изобретения является способ редактирования генома одноклеточного или многоклеточного организма, включающий внесение в по меньшей мере одну клетку указанного организма белка, молекулы ДНК, вектора или системы согласно первому и/или второму объектам настоящего изобретения для внесения разрыва в геномную ДНК указанного организма. Возможен вариант осуществления, дополнительно включающий встраивание в геном экзогенной последовательности ДНК за счет гомологичной репарации. Возможен вариант осуществления, согласно которому экзогенная последовательность ДНК представляет собой один или более участков двунитевой или однонитевой ДНК из генома организма, отличного от организма, геном которого редактируют, или участок ДНК из генома организма, геном которого редактируют, измененный по одному или большему числу положений нуклеотидов. Возможен вариант осуществления, согласно которому организм представляет собой прокариотический или эукариотический организм, в частности, относится к простейшим, бактериям, растениям, грибам, животным, в частности, представляет собой млекопитающее, такое как человек. Возможен вариант осуществления, согласно которому редактирование осуществляют в лечебных целях. Шестнадцатым объектом настоящего изобретения является Белок, молекула ДНК или вектор или система согласно первому и/или второму и/или третьему и/или четвертому и/или пятому и/или шестому объектам настоящего изобретения для применения в терапии. Семнадцатым объектом настоящего изобретения является композиция для образования разрывов в молекуле нуклеиновой кислоты, содержащая белок или молекулу ДНК согласно первому и/или второму и/или третьему объектам настоящего изобретения. Восемнадцатым объектом настоящего изобретения является набор компонентов для редактирования генома, содержащий белок или молекулу ДНК согласно первому и/или второму и/или третьему объектам настоящего изобретения.