|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Исследование аберрантной экспрессии рековерина и других раково-сетчаточных антигенов в злокачественных опухоляхНИР
- Руководитель НИР: Филиппов П.П.
- Участники НИР: Бажин А.В., Ворожейкина И.П., Ганчарова О.С., Головастова М.О., Килина О.В., Савченко М.С., Скорикова Е.Е., Хишов А.С.
- Подразделение: Отдел сигнальных систем клетки
- Срок исполнения: 1 января 2009 г. - 31 декабря 2011 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 09-04-00395-а
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Структура и функционирование клетки. Межклеточные взаимодействия. Молекулярные механизмы клеточной дифференцировки, иммунитета и онкогенеза. Взаимодействие вирус-клетка.
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
-
Рубрики ГРНТИ:
- 31.27.31 Биохимия опухолей
- 76.03.35 Медицинская гистология
-
Ключевые слова:
раково-сетчаточные антигены, рековерин, ген рековерина, аберрантное метилирование, паранеопластические антигены, аутоантитела, рековериновая мрнк, фоторецепторные белки
-
Описание:
Открытый в нашей лаборатории кальцийсвязывающий белок рековерин в норме высокоспецифичен для сетчатки глаза [Дижур А.М., Некрасова Э.Р., Филиппов П.П. Биохимия. 1991;56:225-9; Dizhoor A.M. et al. Science. 1991;251:915-8] и выполняет в них функцию кальциевого сенсора родопсинкиназы (GRK-1) [Gorodovikova E.N., Philippov P.P. FEBS Lett. 1993;335:277-9; Gorodovikova E.N. et al. FEBS Lett. 1994;349:187-190]. При раке рековерин выступает как паранеопластический антиген: он может аберрантно экспрессироваться в опухолях легких [Bazhin A.V. et al. Lung Cancer. 2001;34:99-104; Bazhin A.V. et al. Lung Cancer. 2004;44:193-8]), вызывая у пациентов выработку аутоантител и развитие ретинопатии (cancer-associated retinopathy, CAR). Недавно экспрессия рековерина обнаружена в меланоме, где, как оказалось, аберрантно экспрессируется еще целый ряд других фоторецепторных белков [Bazhin A.V. et al. Cancer Immunol. Immunother. 2007;56:110-6; Bazhin A.V. et al. Int. J. Cancer. 2007;120:1268-76]. На основании этих данных мы сформулировали концепцию раково-сетчаточных антигенов (cancer-retina antigens), т.е. белков, в норме специфичных для сетчатки, но при раке аберрантно экспессируемых в локализованных вне сетчатки опухолях. Также нами впервые найдено, что экспрессия раково-сетчаточных антигенов в меланоме может вызывать выработку аутоантител, приводя к развитию ретинопатии (melanoma-associated retinopathy, MAR) [Bazhin A.V. et al. Int. J. Cancer. 2008, in press], т.е. при меланоме рековерин и другие раково-сетчаточные антигены ведут себя как паранеопластические антигены. Полученные результаты ставят целый ряд вопросов, которые касаются аберрантной экспрессии раково-сетчаточных антигенов и на которые до сих пор не получен ответ. Так, не установлены внутриклеточные мишени для рековерина в клетках опухолей. Недостаточно изучены молекулярные механизмы аберрантной экспресии раково-сетчаточных антигенов в злокачественных опухолях. Нет ответа на вопрос о том, экспрессируются ли раково-сетчаточные антигены (в дополнение к рековерину) в опухолях легких и других отличных от меланомы злокачественных опухолях; в частности, экспрессируются ли рековерин в опухолях, отличных от опухолей легких и меланомы. Наконец, вызывают ли антитела против рековерина гибель раковых клеток подобно тому, как это происходит в случае клеток сетчатки. Отсюда вытекают следующие основные задачи настоящего проекта: 1) установление внутриклеточных мишеней для рековерина в опухолевых клетках; 2) выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе аберрантной экспрессии рековерина в злокачественных опухолях; 3) скриннинг (а) злокачественных опухолей различных типов на экспрессию в них рековерина и некоторых других раково-сетчаточных антигенов и (б) образцов сыворотки крови онкологических пациентов на присутствие аутоантител против рековерина и других раково-сетчаточных антигенов; 4) исследование цитотоксического действия антител против рековерина на опухолевые клетки.
-
Основные результаты:
Задача 1. Завершен поиск внутриклеточной мишени для рековерина в опухолевых клетках. Специфического связывания белков-мишеней для рековерина не было выявлено ни методом аффинного связывания потенциальных мишеней с иммобилизованным рековерином (см. отчет за 2009 год), ни методом иммунопреципитации с поликлональными моноспецифическими антителами против рековерина. Сделан вывод, что в изученных типах опухолевых клеток отсутствуют белки, функционально связанные с рековерином, и, следовательно, рековерин в этих клетках, в отличие от фоторецепторных клеток, не вовлечен в какие-либо сигнальные пути. Поскольку нами в исследование были взяты опухолевые клетки разных типов, сделанный вывод, скорее всего, справедлив и для любых других опухолевых клеток. Задача 2. Ранее мы обнаружили аберрантную экспрессию раково-сетчаточных антигенов в опухолях легких (рековерин) и в кожной меланоме (рековерин и другие раково-сетчаточные антигены). На данном этапе выявлена аберрантная экспрессия рековерина и некоторых других раково-сетчаточных антигенов в аденокарциномах поджелудочной железы, эндометрия, молочной железы и прямой кишки и в кожной Т-клеточной лимфоме. Задача 3. Ранее частота сывороточных аутоантител против рековерина была определена нами для пациентов с опухолями легких и кожной меланомой. На данном этапе проекта завершен анализ образцов сыворотки крови, взятых от пациентов с целым рядом других онкологических заболеваний. Аутоантитела против некоторых других раково-сетчаточных антигенов таких, как родопсин, трансдуцин и аррестин, найдены у некоторых пациентов с аденокарциномой поджелудочной железы.
- Добавил в систему: Скорикова Елена Евгеньевна
Источник финансирования НИР
| грант РФФИ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 января 2009 г.-31 декабря 2009 г. | Исследование аберрантной экспрессии рековерина и других раково-сетчаточных антигенов в злокачественных опухолях |
| Результаты этапа: В соответствии с планом научных исследований по проекту на 2009 год были получены следующие результаты. Задача 1 "Установление внутриклеточных мишеней для рековерина в опухолевых клетках (начало)". Анализ экстрактов 2-х клеточных линий мелкоклеточной карциномы легких (МККЛ) и 1-й линии кожной меланомы, которые спонтанно не экспрессировали рековерин, методом аффинного связывания потенциальных мишеней для рековерина с этим иммобилизованным белком (pull-down approach) не выявил специфического связывания белков-мишеней, присутствующих в клеточных экстрактах. Дальнейшая работа будет проводиться с клеточными линиями рака, которые способны спонтанно экспрессировать рековерин. Задача 2 "Выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе аберрантной экспрессии рековерина в злокачественных опухолях". Методом бисульфитного расщепления проведен анализ уровней метилирования CpG-динуклеотидов в составе гена рековерина в области промотора перед первым экзоном и в самом первом экзоне для (а) целого ряда нормальных тканей, (б) нескольких образцов опухолей и клеточных линий меланомы и (в) линии NCI-N82 МККЛ. Обнаружено, что в норме большинство CpG-динуклеотидов в указанной области гена рековерина высоко метилированы, в то время как практически во всех исследованных образцах опухолей и клеточных линиях меланомы и МККЛ уровень метилирования CpG-динуклеотидов в этой же области гена существенно снижен. При этом выявлена обратная корреляция между уровнями (а) экспрессии мРНК для рековерина и (б) метилирования CpG-динуклеотидов в его гене. Сделаны выводы о том, что (а) метилирование CpG-динуклеотидов в составе гена рековерина в области промотора перед первым экзоном и в самом первом экзоне вовлечено в репрессию синтеза мРНК для рековерина в нормальных тканях и (б) аберрантное деметилирование CpG-динуклеотидов в указанной области гена рековерина лежит в основе аберрантной экспрессии этого белка в опухолевых клетках. Задача 3 "Скрининг злокачественных опухолей различных типов на экспрессию в них рековерина и некоторых других раково-сетчаточных антигенов (начало)". Начато создание коллекции парафинированных срезов злокачественных опухолей различных типов для последующего анализа на экспрессию в них рековерина. Получены аффинно очищенные антитела против рековерина, которые используются для выявления этого белка в парафинированных срезах опухолей. Задача 4 "Скриннинг образцов сыворотки крови онкологических пациентов на присутствие аутоантител против рековерина (ААР) и других раково-сетчаточных антигенов (начало)". Начато формирование коллекции образцов сыворотки крови больных со злокачественными опухолями (1-я группа), доброкачественными опухолями (2-я группа), неопухолевыми заболеваниями (3-я группа). а также индивидуумов без каких-либо диагностированных патологий (4-я группа). Положительная реакция на ААР обнаружена в 23 проанализированных образцах сыворотки крови 1-й (20) и 2-й (3) групп. Все образцы сыворотки 3-й и 4-й групп положительного сигнала не дали. | ||
| 2 | 1 января 2010 г.-31 декабря 2010 г. | Исследование аберрантной экспрессии рековерина и других раково-сетчаточных антигенов в злокачественных опухолях |
| Результаты этапа: Задача 1 «Установление внутриклеточных мишеней для рековерина в опухолевых клетках» (продолжение). Исходно планировалось завершить выполнение этой задачи в течение 2-го года проекта, но из-за невозможности заказа и получения коммерческих рековерин-положительных клеточных линий ретинобластомы завершение задачи перенесено на 3-й год проекта. В отчетном году нами в рамках совместной работы с Университетом Гейдельберга (Германия) получена линия ретинобластомы Y79, продемонстрирована ее способность спонтанно экспрессировать рековерин и начат поиск потенциальной мишени (мишеней) для рековерина в этих злокачественных клетках. Задача 2 «Скрининг злокачественных опухолей различных типов на экспрессию в них рековерина и некоторых других раково-сетчаточных антигенов» (продолжение). На предыдущих этапах проекта следующие раково-сетчаточные антигены (cancer-retina antigens) были выявлены нами в опухолях и некоторых клеточных линиях меланомы: рековерин, родопсин, трансдуцин (Gt), cGMP-фосфодиэстераза (PDE6), cGMP-зависимые катионные каналы, гуанилилциклаза 1 (GC1), родопсинкиназа и аррестин. На данном этапе анализ тканей опухолей и некоторых клеточных линий карциномы поджелудочной железы выявил в них экспрессию ряда раково-сетчаточных антигенов на уровне мРНК и белка. Наибольшей частотой экспрессии характеризуются трансдуцин, cGMP-фосфодиэстераза и гуанилилциклаза 1. Получены доказательства того, что два из перечисленных раково-сетчаточных антигенов, а именно трансдуцин и cGMP-фосфодиэстераза, принимают участие в контроле метаболизма cGMP в клетках меланомы, в которых функционирует сигнальный каскад Wnt5a–рецептор Frizzled-2–трансдуцин–cGMP-фосфодиэстераза. Также начато исследование по выявлению экспрессии рековерина в аденокарциноме эндометрия. Задача 3 «Скрининг образцов сыворотки крови онкологических пациентов на присутствие аутоантител против рековерина и других раково-сетчаточных антигенов» (продолжение). Проведен серийный анализ образцов сыворотки крови пациентов с различными онкологическими заболеваниями на присутствие аутоантител против рековерина (ААР). ААР впервые обнаружены при раке шейки матки, желудка, пищевода, семенников и мочевого пузыря. Установлено, что частота встречаемости ААР при различных типах рака не превышает 10%. Кроме того, начат серийный анализ образцов сыворотки крови пациентов с карциномой поджелудочной железы на присутствие аутоантител против рековерина и других раково-сетчаточных антигенов. Перечисленные задачи были сформулированы в исходной заявке по настоящему проекту и их решение будет продолжено в 2011 году. Сверх этого в отчетном году показано присутствие сигнального каскада Wnt5a–рецептор Frizzled-2–трансдуцин–cGMP-фосфодиэстераза в клетках меланомы и продемонстрирована функциональная значимость раково-сетчаточных антигенов трансдуцина и cGMP-фосфодиэстеразы для этих опухолевых клеток. | ||
| 3 | 1 января 2011 г.-31 декабря 2011 г. | Исследование аберрантной экспрессии рековерина и других раково-сетчаточных антигенов в злокачественных опухолях |
| Результаты этапа: Задача 1. Проведен поиск внутриклеточной мишени для рековерина в опухолевых клетках ретинобластомы Y79, которые аберрантно экспрессируют рековерин. С этой целью использовали метод иммунопреципитации с поликлональными моноспецифическими антителами против рековерина, аффинно очищенными из иммунной сыворотки кролика. Такие антитела копреципитируют из экстракта клеток ретинобластомы Y79 несколько полипептидов в Са-содержащем, но не ЭГТА-содержащем буфере, т.е. процесс копреципитации Са-зависим. Аналогичная картина, однако, была получена и при использовании нормальных иммуноглобулинов вместо моноспецифических антител против рековерина, и, следовательно, выявленное связывание неспецифично. Сделан вывод, что в клетках ретинобластомы Y79, как и в других раковых клетках, проанализированных ранее, отсутствуют белки, функционально связанные с рековерином. Задача 2. Ранее мы показали присутствие аберрантной экспрессии рековерина в злокачественных опухолях легких и кожной меланоме. На данном этапе проекта завершен скрининг злокачественных опухолей различных типов на экспрессию в них рековерина и некоторых других раково-сетчаточных антигенов. Впервые выявлена аберрантная экспрессия рековерина в аденокарциноме эндометрия. Скрининг новых опухолей и клеточных линий аденокарциномы поджелудочной железы, начатый на предыдущем этапе проекта, подтвердил, что в некоторых из них, помимо рековерина, на уровне белка аберрантно экспрессируются и некоторые другие раково-сетчаточные антигены. На уровне мРНК обнаружена аберрантная экспрессия рековерина в аденокарциномах молочной железы и прямой кишки, а также в кожной Т-клеточной лимфоме. Задача 3. Ранее частота сывороточных аутоантител против рековерина (ААР) была определена нами для пациентов с опухолями легких и кожной меланомой. На данном этапе проекта завершен анализ образцов сыворотки крови, взятых от пациентов с целым рядом других онкологических заболеваний; во всех этих случаях частота встречаемости ААР не превышала 10%. Аутоантитела против некоторых других раково-сетчаточных антигенов таких, как родопсин, трансдуцин и аррестин, но не против рековерина, найдены у некоторых пациентов с аденокарциномой поджелудочной железы. Впервые показано, что у пациентов с онкологическими заболеваниями, отличными от рака легких, присутствие в их крови ААР не обязательно вызывает развитие паранеопластической дегенерации сетчатки. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".