Влияние антидепрессантов на скорость транспорта незаменимых аминокислотНИР

Этапы НИР

# Сроки Название
1 12 марта 2011 г.-31 декабря 2011 г. Влияние антидепрессантов на скорость транспорта незаменимых аминокислот
Результаты этапа: В течение первого года работы по теме гранта мы получили частичное подтверждение правильности нашей гипотезы. Мы предполагали, что селективные блокаторы обратного захвата дофамина и серотонина, лекарственные препараты флуоксетин и бупропион, вызывают существенное снижение скорости поглощения незаменимых аминокислот через транспортеры, снабжающие аминокислотами все клетки организма. Было известно, что указанные лекарства взаимодействуют с белковыми молекулами, осуществляющими обратный захват медиатора из синаптической щели нейрона. На этом основано их антидепрессантное лечебное действие. Известно также, что рецепторы, осуществляющие обратный захват медиатора (нейромедиаторные транспортеры – NTTs), являются близкими родственниками аминокислотных транспортеров (NATs), которые переносят пищевые аминокислоты внутрь клеток и обеспечивают незаменимыми аминокислотами все клетки организма. Оба типа транспортеров были объеденины в одно семейство SLC6. Нами был проведен детальный биоинформационный анализ генов человека, мыши, дрозофиллы и комара, относящихся к семейству SLC6, и найдены общие консервативные участки. Поскольку в лаборатории уже была кДНК аминокислотного транспортера AgNAT8 из эпителия кишечника комара, мы наладили метод гетерологической экспрессии в ооцитах лягушки белка, полученного с использованием этой кДНК. В условиях двухэлектродной фиксации потенциала на мембране ооцита мы исследовали токи, которые текут через транспортер при аппликации аминокислот. Мы показали, что антидепрессанты флуоксетин (прозак) и бупропион подавляют ток аминокислот через транспортер AgNAT8 из эпителия кишечника комара в среднем на 30 – 50 %. Была проведена статистическая обработка полученных экспериментальных данных. Эксперименты необходимо продолжить на аминокислотных транспортерах из эпителия кишечника человека.
2 17 мая 2012 г.-31 декабря 2012 г. Влияние антидепрессантов на скорость транспорта незаменимых аминокислот
Результаты этапа: В течение второго (2012) года мы получили аминокислотный транспортер человека SLC6A19 и серотониновый транспортер человека SERT из фирм DNASU (http://dnasu.asu.edu) и ADDGENE (http://www.addgene.org/15483/) соответственно. Транспортер человека SERT необходим для положительного контроля, т.к. в научной литературе описано влияние флуоксетина на SERT – транспортер, осуществляющий обратный захват серотонина из синаптической щели. Флуоксетин подавляет обратный захват серотонина, что приводит к облегчению медицинской депрессии. Для получения гетерологической экспрессии человеческого транспортера в ооцитах лягушки, в ооциты инъецируют РНК, а не ДНК, как при работе с клетками млекопитающих. Поэтому нам необходимо было выделить кДНК из купленных векторов, рассчитанных на трансфекцию клеток млекопитающих, и клонировать ее в вектор EpXOON. В этом векторе открытая рамка считывания, кодирующая исследуемый белок, слита на С’-конце с открытой рамкой считывания флуоресцентного белка GFP (без стоп кодона) и окружена 5' и 3' нетранслируемыми последовательностями из глобина шпорцевой лягушки. Эти нетранслируемые последовательности стабилизируют РНК и увеличивают синтез чужеродного белка в ооцитах шпорцевой лягушки. Мы клонировали hSLC6A19 и hSERT в вектор EpXOON. Открытые рамки считывания hSLC6A19 и hSERT из коммерческих векторов были амплифицированы при помощи ПЦР. Специально подобранные для этого праймеры были удлинены сайтами рестрикции ферментов EcoRI и HindIII. Продукты ПЦР были клонированы в вектор EpXOON, который предварительно был обработан теми же рестриктазами. Полученные конструкции hSLC6A19/EpXOON и hSERT/EpXOON использовали для получения мРНК с помощью транскрипционного кита mMESSAGEmMACHINE (Ambion), который обеспечивает стабильно высокий синтез кэпированной РНК. Для оценки сохранности транскриптов, а также количества РНК, использовали метод электрофореза в агарозном геле. Таким образом, за 2012 год мы выполнили всю генно-инженерную часть проекта и сейчас мы имеем транскрипты генов серотонинового и аминокислотного транспортеров человека, подготовленные для инъекции в ооциты Xenopus.
3 18 апреля 2013 г.-31 декабря 2013 г. Влияние антидепрессантов на скорость транспорта незаменимых аминокислот
Результаты этапа: В работе исследовалось влияние селективного блокатора обратного захвата серотонина флуоксетина на транспорт незаменимых аминокислот триптофана и фенилаланина через транспортеры человека SLC6A19 и SERT, а также AgNAT8. Флуоксетин это лекарственный препарат, широко используемый при лечении депрессий. Лечебное действие основано на способности флуоксетина блокировать транспорт серотонина из синаптических щелей обратно в серотонинергические нейроны. Мы предположили, что флуоксетин вызывает также существенное снижение скорости поглощения незаменимых аминокислот через транспортеры, снабжающие аминокислотами все клетки организма. Таким образом, в процессе лечения депрессии клетки не дополучают незаменимых аминокислот, что приводит к снижению синтеза серотонина и общему голоданию организма. Мы сформулировали гипотезу,согласно которой флуоксетин оказывает два противоположно направленные влияния: увеличивает время действия серотонина на постсинаптический нейрон и одновременно снижает синтез серотонина в нейронах и других клетках организма. Известно, что нейротрансмиттерные транспортеры (NTTs) и аминокислотные транспортеры (NATs) являются близкими родственниками: оба типа транспортеров объединены в одно семейство SLC6. В рамках данной работы нами был проведен детальный биоинформационный анализ генов человека, мыши, дрозофилы и комара, относящихся к семейству SLC6, и найдены общие консервативные участки. Дальнейшая экспериментальная работа подтвердила наше предположение о том, что флуоксетин взаимодействует с консервативными участками молекул и существенно подавляет транспорт аминокислот как через транспортер SLC6A19 человека, так и через относительно далекий в филогенетическом плане транспортер AgNAT8 из эпителия кишечника комара. В работе мы использовали метод гетерологической экспрессии исследуемых транспортеров в ооцитах лягушки Xenopus laevis. Фрагменты генов, кодирующие транспортеры SLC6A19 и SERT человека и транспортер AgNAT8 комара были клонированы в специальную плазмиду EpXOON, адаптированную для использования в ооцитах лягушки. Полученные конструкции использовали для получения транскриптов, которые инъецировали в ооциты. Об экспрессии транспортера на мембране ооцита судили по интенсивности свечения белка GFP, РНК которого была соединена с исследуемой РНК без стоп-сигнала (fusion proteins). Известно, что аминокислотные транспортеры используют энергию концентрационного градиента ионов натрия для переноса аминокислоты через мембрану. Одновременно с одной молекулой аминокислоты в клетку поступают один или два ионы натрия. Мы исследовали ток ионов через транспортеры в условиях двухэлектродной фиксации потенциала на мембране ооцита. Был проведен сравнительный анализ токов в норме и при воздействии антидепрессанта флуоксетина, определена сила и длительность эффектов. Мы показали, что в тех концентрациях, в которых флуоксетин оказывает выраженное влияние на серотониновый транспортер SERT (1-10mM), он подавляет ток аминокислот через транспортер SLC6A19 человека и транспортер AgNAT8 из эпителия кишечника комара в среднем на 30 %. Таким образом, существующее в современной медицинской литературе представление о селективном действии флуоксетина на организм далеко от истины. Из нашей работы следует, что вещества блокирующие одну группу белковых молекул (в нашем случае это блокаторы нейромедиаторных транспортеров) с большой вероятностью действуют на близкородственные в филогенезе молекулы (в нашем случае - на аминокислотные транспортеры). Флуоксетин действует не только в синаптической щели, но, в той или иной степени, на все клетки организма. Этим, по-видимому, объясняются многочисленные побочные эффекты флуоксетина. Данная работа указывает на место, где надо проводить дополнительную проверку на специфичность новых поколений антидепрессантов.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".