Идентификация мутаций устойчивости к фунгицидам в геноме грибов-патогенов пасленовыхНИР

Fungicides resistance mutations in the pathogenic fungi genome

Источник финансирования НИР

грант Президента РФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 15 февраля 2018 г.-31 декабря 2018 г. Идентификация мутаций устойчивости к фунгицидам в геноме грибов-патогенов пасленовых
Результаты этапа: Были проведены работы по определению мутаций устойчивости у изолятов Alternaria alternata sensu lato. Из коллекции депозитария живых систем были отобраны штаммы Alternaria alternata, и проведены работы по выделению ДНК. Идентификация мутации устойчивости G143A к азоксистробину у мелкоспоровых видов Alternaria проводилась двумя методами: с помощью аллельспецифичной ПЦР и прямого секвенирования гена цитохрома B. Для проведения ПЦР использовали следующий набор праймеров (Ma, Michailides, 2004; Luo et al., 2007): Прямой ARF4: 5’-ATG AGA GAT GTA AAT AAT GGG TGA T, Обратный ARR4: 5’-AAG GTT AGT AAT AAC TGT TGC AG, Обратный ASR: 5’-AAG GTT AGT AAT AAC TGT TGC AC. В результате ПЦР с указанными праймерами получается фрагмент гена Cyt b длиной 246 п.н. Появление ПЦР-продукта при амплификации с парой праймеров ARF4 – ASR свидетельствовало о наличии аллеля дикого типа (чувствительного к стробилуринам) гена Cyt b, с парой ARF4 – ARR4 – показывало наличие мутации G143A, обеспечивающей устойчивость к стробилуринам. Проведенные нами эксперименты по аллель-специфичной ПЦР–идентификации этой мутации показали её отсутствие у 33 исследованных изолятов с разными уровнями устойчивости к азоксистробину, выделенными из пораженных образцов картофеля и томата в разных регионах России. Поэтому были определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена цитохрома B, с помощью прямого праймера ARF4 и обратного cytBr (5’ – CAA TAT CTT GTC CAA TTC ATG GTA T). Определение последовательности нуклеотидов гена цитохрома b (секвенирование) было проведено у 6 изолятов мелкоспоровых видов из Костромской, Астраханской, Ленинградской областей, Марий Эл и Татарстана, с низкой и высокой устойчивостью к азоксистробину. Однако ни в одном случае мутации G143A выявлено не было. По-видимому, устойчивость российских штаммов обусловлена другими механизмами. В результате ПЦР с указанными праймерами получается фрагмент гена Cyt b длиной 246 п.н. Пара ARF4 – cytbr позволяет выявить наличие аллеля дикого типа (чувствительного к стробилуринам) гена Cyt b. Были проведены работы по подбору систем детекции мутации F129L для ПЦР в реальном времени. В настоящее время подобраны 2 возможные флуоресцентные пробы.
2 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Идентификация мутаций устойчивости к фунгицидам в геноме грибов-патогенов пасленовых
Результаты этапа: Проведен скрининг штаммов Helmintosporium solai на устойчивость к фунгицидам, дифеноконазолу, азоксистробину, тиабендазолу, коллоидному серебру. Дифеноконазол (ЕС50 <0,12 мг / л) и коллоидное серебро (ЕС50 <76 мг / л) были наиболее эффективными фунгицидами. Штаммов, устойчивых к вышеупомянутым фунгицидам, обнаружено не было. В большинстве случаев азоксистробин был эффективен против H. solani (EC 50 <7 мг / л), но было несколько штаммов с высокой устойчивостью к этому фунгициду (EC 50> 100 мг / л). Тиабендазол, по-видимому, эффективен против чувствительных штаммов H. solani (ЕС50 <7,3 мг / л); однако шесть исследованных штаммов из России и Нидерландов оказались чрезвычайно устойчивыми к нему (ЕС50> 1000 мг / л). Штамм RMCh2 обладал мутацией в кодоне 200, приводящей к замене Phe (TTC) на Tyr (TAC). Штаммы РМЧ24, РКСу10, Н16 обладали мутацией в кодоне 198 с образованием замен Glu (GAG) на Gln (CAG). Исследования устойчивости штаммов Colletotrichum coccodes показали отсутствие штаммов с высокой устойчивостью к дифеноконазолу и коллоидному серебру. Тиабендазол был очень эффективен в большинстве случаев. Флудиоксонил ингибировал рост C. coccodes (EC50 составлял 0,60–0,90 мг / л), но при культивировании в течение более 20 дней штаммы образовывали стабильные сектора, которые росли быстрее, чем исходный изолят. Тесты на чувствительность Rhizoctonia solani к пенцикурону и флудиоксонилу проводили in vitro с различными концентрациями активных ингредиентов: от 0 до 100 мкг на мл среды в трех повторностях. Большинство штаммов не могли расти на средах с фунгицидами. Несколько штаммов были способны расти на среде с 1 мкг / мл флудиоксонила и даже на 1000 мкг / мл пенцикурона. Были изучены 33 изолята Alternaria solani выделенных из картофеля и томата в 2016-2018 г. Использованные в работе изоляты были изучены на устойчивость к азоксистробину ( Во всех популяциях A. solani выявлены штаммы, сильно различающиеся по уровням устойчивости. Высокочувствительных (ЕС50 менее 1 мкг/мл) не было выявлено ни в одном регионе. Повсеместно преобладали высокоустойчивые штаммы с уровнем ЕС50 более 100 мкг/мл. С другой стороны, устойчивость мицелия к азоксистробину может и не быть решающим фактором эффективного воздействия на патоген при полевом применении. Так, показано, что азоксистробин более эффективно воздействует на прорастающие конидии возбудителей, а не непосредственно на рост мицелия. Для проверки этого предположения мы изучили прорастаемость конидий 5 изолятов. Только для штамма A16PrPL45 EC50 > 1000 мкг/мл. Для остальных штаммов EC50 был существенно ниже. Таким образом, прорастающие конидии оказались более восприимчивы к фунгициду, чем мицелий. Это хорошо согласуется с литературными данными (Bartlett et al., 2002). Предполагают, что азоксистробин эффективнее воздействует на патогены на стадии их прорастания из спор потому, что он ингибирует процесс, связанный с получением энергии (дыхательную цепь) и снижает выработку АТФ в клетке. Такое действие оказывается критическим именно в момент активных ростовых и морфогенетических процессов при прорастании. Одной из распространенных причин повышения устойчивости штаммов грибов к фунгицидам являются мутации. Поэтому проводилось секвенирование гена цитохрома b и 3х субьединиц SDH. Получены последовательности всего гена SdhB (1082 п.н.). Ген содержит три интрона и открытую рамку считывания (ORF), кодирующую белок из 308 аминокислот. Последовательности не содержали известные для этого гена мутации устойчивости (H278Y, H278R). Однако в гене был обнаружен ряд замен, часть из которых была характерна для всех изолятов, выделенных из томата. Замена в 95 нуклеотиде находится в некодирующих последовательностях - интронах и не транслируются в аминокислоты, а остальные замены не вызывают изменений в аминокислотах. После секвенирования части SdhC гена были получены последовательности длинной 570 п.н., содержащие один интрон и ORF, кодирующую белок из 160 аминокислот. Было обнаружено 2 замены у штаммов, выделенных как с картофеля, так и с томата. Замена G на A в 123 нуклеотиде находится в интроне и не транслируется в белок. Замена С→T в 518 основании не приводит к изменению в последовательности белка. Замены H134R в исследованных штаммах обнаружено не было. Полная последовательность гена SdhD имеет длину 607 п.н. с одни интроном и ORF, кодирующей белок из 185 аминокислот. Несмотря на то, что замены H133R, вызывающей высокую устойчивость к боскалиду, в гене содержится целый ряд замен. Восемь разных SNP в кодирующей области гена sdhD. Эти замены были специфичны для всех 16 штаммов, выделенных из томата. SNP в кодоне 48 был не синонимичным и кодировал 2 разных аминокислоты: валин для картофельных и изолейцин для томатных изолятов. Таким образом, было обнаружено, что три SNP в sdhB и 8 в sdhD дифференцируют изоляты, выделенные с картофеля и томата. Анализ последовательности субъединиц гена sdh показал, что эти изоляты более тесно связаны друг с другом, чем с другими видами Alternaria (A. alternata и A. brassicae).

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".