![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Проект направлен на создание нового типа биоразлагаемых наноконтейнеров на основе блок-сополимера тирозина и этиленоксида (пТир-ПЭГ). Тирозин является одной из наиболее гидрофобных аминокислот, поэтому сополимеры пТир-ПЭГ должны формировать стабильные мицеллы, проявляющие высокую устойчивость при разбавлении. Гидрофобный блок пТир может встраиваться в биологические мембраны, меняя их проницаемость по отношению к лекарственным соединениям. С другой стороны, вследствие высокой реакционной способности фенольной боковой цепи, тирозин является удобной платформой для создания наноконтейнеров, пригодных для инкапсулирования лекарственных соединений различной природы. В связи с этим, работа будет проводиться по двум основным направлениям: (1) изучение закономерностей взаимодействия пТир-ПЭГ с модельными липидными мембранами и мембранами живых клеток и (2) создание наноконтейнеров для инкапсулирования различных соединений. Для этого будут синтезированы блок-сополимеры пТир-ПЭГ различного состава. В отличие от большинства блок-сополимеров, полипептиды позволяют управлять строением гидрофобного ядра мицелл за счёт контролируемой на стадии синтеза стереорегулярности аминокислотных остатков. Стеореорегулярные последовательности способствуют образованию жестких упорядоченных вторичных структур, тогда как рацемические полипептиды не обладают таким свойством. Этот вопрос будет исследован в настоящем проекте путем сравнения свойств полимеров, полученнх на основе оптически чистого L-тирозина и рацемической смеси. Изучение взаимодействия пТир-ПЭГ с липосомами позволит выявить взаимосвязь между строением сополимеров и степенью их воздействия на структуру липидного бислоя. В экспериментах на клеточных культурах будут проанализированы биологические эффекты, вызываемые пТир-ПЭГ. Для изучения возможности использования мицелл пТир-ПЭГ в качестве наноконтейнеров будут исследованы их размер, форма и взаимодействие с различными цитостатическими препаратами (доксорубицин, паклитаксель, цисплатин). Для усиления взаимодействия мицелл с металлосодержащими цитостатиками сополимеры будут модифицированы диазониевой солью 4-аминосалициловой или 4-аминобензойной кислоты. Для дополнительной стабилизации наноконтейнеров и улучшенного контроля за высвобождением лекарства, в мицеллы будут введены дополнительные биодеградируемые сшивки за счет использования диазониевой соли бис-(4-аминобензоил-цистина). Это позволит получить наноконтейнеры, способные к длительной циркуляции в кровотоке вследствие наличия на их поверхности длинных полиэтиленоксидных цепей, и быстрому высвобождению лекарства после попадания в целевые клетки за счет протеолитического расщепления пептидных связей в блоке политирозина и раскрытию дисульфидных групп цистина.
The Project is aimed to the development of a novel type of biodegradable nanocontainers composed from tyrosine and ethylene oxide block copolymers (pTyr-PEG). On one hand, tyrosine is one of the most hydrophobic amino acids and therefore it can form micelles which should be stable upon dilution. These hydrophobic blocks can incorporate into lipid bilayers, affecting their permeability towards drugs. Due to high reactivity of phenolic side chain, pTyr-PEG can be readily modified and used as novel nanocontainers suitable for encapsulation of drugs of different chemical structure. So, the work will be developed in two main directions: (i) study of the regularities which determine pTyr-PEG interaction with model lipid bilayers and (ii) development of nanocontainers for encapsulation of different compounds. In the course of the Project, pTyr-PEG block copolymers of various compositions and stereoregularity will be synthesized. In contrast to the majority of synthetic polymers, chemistry of polypeptides gives an opportunity to manipulate the structure of micellar hydrophobic core by means of stereoregularity of the structures controlled during the synthesis. Stereoregular polyamino acids chains form secondary structures, while racemic polypeptides do not. To address this issue, either optically pure L-tyrosine or D,L-racemic mixture will be utilized for the synthesis, allowing to evaluate the role of stereoregularity of the hydrophobic block in its micellization and interaction with biological membranes. Interaction of pTyr-PEG with liposomes will reveal the relationship between copolymer structure and its effect on the structure of lipid bilayer. Cell culture experiment will reveal biological effects of pTyr-PEG block copolymers. To assess the applicability of pTyr-PEG micelles as nanocontainers their size, shape and interaction with different drugs (doxorubicin, paclitaxel and cisplatin) will be studied. To enhance interaction of the micelles with metal-containing cytostatics, pTyr-PEG will be modified with diazonium salts of 4-aminosalicylic or 4-aminobenzoic acids. Further stabilization of the nanocontainers and improvement of the controlled release of drugs will be achieved by insertion of additional biodegradable cross-links. For this pupose, the copolymer micelles will be modified with diazonium salt of bis-(4aminobenzoyl-cystine). This will produce nanocontainers capable of prolonged circulation in the bloodstream owing to the presence of long polyethylene oxide chans on their surface and rapid release of the payload in the target cells due to proteolytic degradation of peptide bonds in the pTyr block and cleavage of disulfide cysteine bonds.
В соответствии с планом к концу первого года выполнения проекта мы планируем получить следующие результаты. 1) Методом полимеризации N-карбосиангидридов L-тирозина и D,L-тирозина с раскрытием цикла получены блок-сополимеры пТир-ПЭГ. Состав и молекулярно-массовые характеристики сополимеров определены методами ЯМР и ГПХ. 2) Методом флуоресцентной спектроскопии определены критические концентрации мицеллообразования. 3) Методом электронной микроскопии исследована форма мицелл блок-сополимеров различного состава и степени полимеризации. 4) Методом динамического светорассеяния определены размеры мицелл образующихся ассоциатов для сополимеров различного состава. Исследована корреляция между составом сополимеров, формой и размером образующихся частиц. 5) Исследовано влияние сополимеров на структуру липидного бислоя. Получены количественные корреляции между составом сополимеров и их влиянием на проницаемость липидного бислоя. 6) Исследована цитотоксичность сополимеров пТир-ПЭГ. Построены количественные корреляции между составом сополимеров и их концентрацией, вызывающей выживание 50% клеток в культуре. 7) Изучено влияние сополимеров на продукцию активных форм кислорода.
Показана способность плюроников ускорять транспорт доксорубицина через модельные липидные мембраны. Исследовано влияние структуры плюроников на их способность увеличивать проницаемость биологических мембран. Показано, что фактором, определяющим эффективность действия плюроников на проницаемость, является содержание в них полипропиленоксида. Впервые показана способность плюроников ускорять трансмембранный перенос липидов (флип-флоп). Исследована взаимосвязь между структурой линейных амфифильных блок-сополимеров и их способностью ускорять флип-флоп в липидных мембранах. На выборке, содержащей 19 амфифильных сополимеров различной структуры, выявлена двухпараметрическая корреляция между флиппазной активностью сополимеров и линейной комбинацией их гидрофобности и объёма гидрофобного блока. Исследовано влияние состава липидных мембран на их способность взаимодействовать с плюрониками. Исследована способность амфифильных блок-сополимеров увеличивать накопление противоопухолевых антибиотиков в раковых клетках. Изучено связывание амфифильных полиалкиленоксидов с модельными липидными мембранами и мембранами живых клеток. Показано, что увеличение длины полиэтиленоксидного блока способствует захвату полимеров клетками, однако препятствует их связыванию с липосомами. Полученные результаты имеют большое значение для понимания механизмов взаимодействия полимерных носителей с клеточными мембранами. Исследованы количественные корреляции между структурой низкомолекулярных соединений и их способностью связываться с мицеллами плюроников.
(1) Методом полимеризации с раскрытием цикла синтезированы три ряда блок-сополимеров тирозина и этиленоксида, различающиеся длиной полиэтиленоксидного блока, и состоящие из 3-4 образцов,различающихся длиной политирозинового блока. Массовое содержание тирозина в каждом из рядов варьирует от 20 до 80%. тирозина и D,L-тирозина с раскрытием цикла получены блок-сополимеры пТир-ПЭГ. Состав и молекулярно-массовые характеристики сополимеров определены методами ЯМР и ГПХ. (2)С использованием гидрофобного зонда пирена, спектр флуоресценции которого чувствителен к полярности микроокружения, были определены критические концентроации мицеллообразования некоторых сополимеров. Показано, что ККМ всех плученных сополимеров лежит в области микромолярных концентраций и астет с уменьшением содержания тирозина в составе сополимера. Изучени структуры мицелл с помощью другого флуоресцентного зонда - перилена - выявило наличие большой эксимерной полосы в спектре его флуоресценции. Это указывает на чрезвычайно высокую локальную упорядоченность гидрофобного ядра мицелл п политирозина. (3) Формы ассоциатов политирозина в водном растворе была исслеована несколькими доступными электронно-микроскопическими методами. Интерес к этому исследованию вызван тем, что, согласно теории стабильности коллоидных систем, амфифильные блок-сополимеры, гидрофобный блок которых состоит из 50-80 гидрофобных звеньев и имеет молекулярную массу порядка 10000 г/моль, а гидрофильный значительно легче (порядка 2-5000 г/моль), не склонны к формированию малых сферических мицелл. Скорее, такие сополимеры могли бы формировать вытянутые стержнеобразные мицеллы или сферические слоистые везикулы. Во-первых, методом просвечивающей электронной микроскопии были исследованы тонкие пленки водных растворов сополимеров, контрастированные вольфраматом натрия, во-вторых, тонкие пленки, высушенные на воздухе, были исследованы методом сканирующей электронной микроскопии. Интересно, что оба метода исследования высушенных пленок дали один и тот же результата: независимо от степени полимеризации тирозинового блока и доли тирозина с составе сополимера, полимеры формировали сферические частицы. Нельзя полностью исключить, что этот результат является следствием способа приготовления образцов: при высыхании растворов полимер образует пленку, внутри которой формируются сферические неоднородности. При этом геометрия этих неоднородностей в растворе сильно отличается. (6) Тот факт, что взаимодействие блок-сополимеров тирозина и этиленоксида с липосомами не приводит к повышению проницаемости липосомальной мембраны, позволяет предположить, что несмотря на ярко выраженные поверхностно-активные свойства этих сополимеров, они не склонны встраиваться в липидные бислои или/и их встраивание не приводит к возмущению липидной упаковки. Исследование цитотоксичности этих сополимеров полностью подтвердило этот вывод. Оказалось, что блок-сополимеры, содержащие блок полиэтиленоксида со степенью полимеризации 115 и имеющие от 11 до 89 тирозиновых звеньев в гидрофобном блоке, практически не проявляли токсичности по отношению к клеткам MCF-7/ADR вплоть до концентрации 1 мг/мл. Это означает, что такие поверхностно-активные сополимеры могут использоваться как нетоксичные носители лекарственных соединений. (7) Влияние блок-сополимеров на нсодержание в клетках активных форм кислорода. Сополимеры на основе политирозина могут принимать участие в перекисных процессах внутри клеток. Э о вызвано тем, что окислительно-восстановительный потенциал тирозина, хоть и не очень мал, сильно зависит от его микроокружения. Поэтому в составе сополимера он может снижаться. Для оценки влияния сополимеров на концентрацию активных форм кислорода в клетках мы использовали дигидро-дихлорфлуоресцеин диацеат. Оказалось, что обработка клеток блок-сополимерами не влияла на уровень продукции активных форм кислорода в клетках. В дальнейшем мы планируем исследовать этот вопрос более детально, в частности, изучить отсроченные эффекты поитирозина на продукцию активных форм кислорода, а также исследовать влияние политиозина на слетки, в которых окислительный стресс был вызван искусственно. (8) Исследование молекулярных мишеней сополимеров в живых клетках методом фотоаффинного мечения. Молекулярные мишени блок-сополимеров в клетках, как правило, не исследованы. Между тем эта проблема чрезвычайно важна для исследования причин биологических эффектов сополимеров. Для решения проблемы выявления молекулярных мишеней блок-сополимеров мы впервые применили метод фоточувствительных зондов. Данный метод основан на использовании молекул, образующих при облучении чрезвычайно активные частицы – карбен или нитрен, которые способны присоединяться к любым молекулам в ближайшем окружении. Этот подход давно и успешно применяется в молекулярной биологии для выявления молекулярных мишеней ферментов и низкомолекулярных синтетических ингибиторов, однако, насколько нам известно, до настоящего времени не применялcя для выявления молекулярных мишеней синтетических сополимеров. Данный подход был апробирован на примере двублочного сополимера этиленоксида и пропиленоксида, имеющего единственную гидроксильную группу на гидрофобном конце макромолекулы. К этой гидроксильной группе был присоединен остаток трифтометилдиазиринилбензойной кислоты, способной образовывать карбен при облучении УФ-светом. При этом сополимер содержал в среднем около 1 атома трития на макромолекулу, что позволяло легко детектировать его в субклеточных фракциях методом сцинтилляционного счета. Оказалось, что обработка раковых клеток блок-сополимером, несущим данную метку, приводит к эффективному присоединению сополимера к липидам клеточных мембран. При этом анализ белковой фракции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле показал, что белки практически не содержали пришитого сополимера. Данный вывод был также дополнительно доказан методами авторадиографии на клетках. Таким образом, в данной части работы была показана применимость метода фоточувствительных зондов для изучения молекулярных мишеней блок-сополимеров в клетках. (9) Исследование способности блок-сополимеров тирозина и этиленкосида восстанавливать золотохлористоводородную кислоту. Коллоидные частицы золота находят множество приложений в биосенсорных системах, катализе и терапии. Медицинские применения золотых наночастиц требуют их включения в биосовметимые носители, обеспечивающие возможность циркуляции в кровотоке и последующего выведения наночастиц. Амфифильные блок сополимеры этиленоксида и аминокислот являются эффективными носителями для подобных задач. Полиаминокислотный , в частности, политирозиновый, блок может связываться с металлическим золотом (гидрофобные взаимодействия), а полиэтиленоксидный блок способен стабилизировать частицы в растворе, а также обладает биосовместимостью. В связи с этим, в данной части работы мы исследовали возможность синтеза коллоидных частиц золота в реакции HAuCl4 с блок-сополимером этиленоксида и тирозина в водной среде и контролировать размер и свойства частиц с помощью изменения соотношения блоков в сополимере. Для проведения реакции синтезированные сополимеры диспергировали в воде путем 50-100-кратного разбавления раствора N,N-диметилформамиде водой, в результате чего образовывались мицеллы со средним гидродинамическим диаметром 20-1000 нм в зависимости от состава сополимера. Добавление HAuCl4 приводило к образованию коллоидных частиц золота, размер и форма которых зависели от состава блок-сополимера. Исследование полученных образцов с помощью УФ-спектроскопии и просвечивающей электронной микроскопии показало, что в присутствии блок-сополимеров с содержанием тирозина 20-40% формируются крупные тригональные золотые наночастицы размером 20-300 нм и характеризующиеся интенсивной полосой возбуждения поверхностных плазмонов. В присутствии сополимеров, содержащих 60-80% политирозина образуются частицы размером менее 2 нм, способные флуоресцировать. Такие частицы с несформированной зонной структурой называются золотыми нанокластерами и вызывают большой интерес в связи с возможностью их использования в биосенсорных системах. Таким образом, мы впервые показали возможность образования коллоидных частиц золота при взаимодействии HAuCl4 с блок-сополимерами этиленоксида и аминокислот, а также установили зависимость свойств получаемых частиц от состава сополимера.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 11 февраля 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Взаимодействие биоразлагаемых амфифильных блок-сополимеров на основе политирозина с липидными мембранами, низкомолекулярными лекарствами и раковыми клетками |
Результаты этапа: (1) Методом полимеризации с раскрытием цикла синтезированы три ряда блок-сополимеров тирозина и этиленоксида, различающиеся длиной полиэтиленоксидного блока, и состоящие из 3-4 образцов,различающихся длиной политирозинового блока. Массовое содержание тирозина в каждом из рядов варьирует от 20 до 80%. тирозина и D,L-тирозина с раскрытием цикла получены блок-сополимеры пТир-ПЭГ. Состав и молекулярно-массовые характеристики сополимеров определены методами ЯМР и ГПХ. (2)С использованием гидрофобного зонда пирена, спектр флуоресценции которого чувствителен к полярности микроокружения, были определены критические концентроации мицеллообразования некоторых сополимеров. Показано, что ККМ всех плученных сополимеров лежит в области микромолярных концентраций и растет с уменьшением содержания тирозина в составе сополимера. Изучени структуры мицелл с помощью другого флуоресцентного зонда - перилена - выявило наличие большой эксимерной полосы в спектре его флуоресценции. Это указывает на чрезвычайно высокую локальную упорядоченность гидрофобного ядра мицелл п политирозина. (3) Формы ассоциатов политирозина в водном растворе была исслеована несколькими доступными электронно-микроскопическими методами. Интерес к этому исследованию вызван тем, что, согласно теории стабильности коллоидных систем, амфифильные блок-сополимеры, гидрофобный блок которых состоит из 50-80 гидрофобных звеньев и имеет молекулярную массу порядка 10000 г/моль, а гидрофильный значительно легче (порядка 2-5000 г/моль), не склонны к формированию малых сферических мицелл. Скорее, такие сополимеры могли бы формировать вытянутые стержнеобразные мицеллы или сферические слоистые везикулы. Во-первых, методом просвечивающей электронной микроскопии были исследованы тонкие пленки водных растворов сополимеров, контрастированные вольфраматом натрия, во-вторых, тонкие пленки, высушенные на воздухе, были исследованы методом сканирующей электронной микроскопии. Интересно, что оба метода исследования высушенных пленок дали один и тот же результата: независимо от степени полимеризации тирозинового блока и доли тирозина с составе сополимера, полимеры формировали сферические частицы. Нельзя полностью исключить, что этот результат является следствием способа приготовления образцов: при высыхании растворов полимер образует пленку, внутри которой формируются сферические неоднородности. При этом геометрия этих неоднородностей в растворе сильно отличается. (6) Тот факт, что взаимодействие блок-сополимеров тирозина и этиленоксида с липосомами не приводит к повышению проницаемости липосомальной мембраны, позволяет предположить, что несмотря на ярко выраженные поверхностно-активные свойства этих сополимеров, они не склонны встраиваться в липидные бислои или/и их встраивание не приводит к возмущению липидной упаковки. Исследование цитотоксичности этих сополимеров полностью подтвердило этот вывод. Оказалось, что блок-сополимеры, содержащие блок полиэтиленоксида со степенью полимеризации 115 и имеющие от 11 до 89 тирозиновых звеньев в гидрофобном блоке, практически не проявляли токсичности по отношению к клеткам MCF-7/ADR вплоть до концентрации 1 мг/мл. Это означает, что такие поверхностно-активные сополимеры могут использоваться как нетоксичные носители лекарственных соединений. (7) Влияние блок-сополимеров на нсодержание в клетках активных форм кислорода. Сополимеры на основе политирозина могут принимать участие в перекисных процессах внутри клеток. Э о вызвано тем, что окислительно-восстановительный потенциал тирозина, хоть и не очень мал, сильно зависит от его микроокружения. Поэтому в составе сополимера он может снижаться. Для оценки влияния сополимеров на концентрацию активных форм кислорода в клетках мы использовали дигидро-дихлорфлуоресцеин диацеат. Оказалось, что обработка клеток блок-сополимерами не влияла на уровень продукции активных форм кислорода в клетках. В дальнейшем мы планируем исследовать этот вопрос более детально, в частности, изучить отсроченные эффекты поитирозина на продукцию активных форм кислорода, а также исследовать влияние политиозина на слетки, в которых окислительный стресс был вызван искусственно. (8) Исследование молекулярных мишеней сополимеров в живых клетках методом фотоаффинного мечения. Молекулярные мишени блок-сополимеров в клетках, как правило, не исследованы. Между тем эта проблема чрезвычайно важна для исследования причин биологических эффектов сополимеров. Для решения проблемы выявления молекулярных мишеней блок-сополимеров мы впервые применили метод фоточувствительных зондов. Данный метод основан на использовании молекул, образующих при облучении чрезвычайно активные частицы – карбен или нитрен, которые способны присоединяться к любым молекулам в ближайшем окружении. Этот подход давно и успешно применяется в молекулярной биологии для выявления молекулярных мишеней ферментов и низкомолекулярных синтетических ингибиторов, однако, насколько нам известно, до настоящего времени не применялcя для выявления молекулярных мишеней синтетических сополимеров. Данный подход был апробирован на примере двублочного сополимера этиленоксида и пропиленоксида, имеющего единственную гидроксильную группу на гидрофобном конце макромолекулы. К этой гидроксильной группе был присоединен остаток трифтометилдиазиринилбензойной кислоты, способной образовывать карбен при облучении УФ-светом. При этом сополимер содержал в среднем около 1 атома трития на макромолекулу, что позволяло легко детектировать его в субклеточных фракциях методом сцинтилляционного счета. Оказалось, что обработка раковых клеток блок-сополимером, несущим данную метку, приводит к эффективному присоединению сополимера к липидам клеточных мембран. При этом анализ белковой фракции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле показал, что белки практически не содержали пришитого сополимера. Данный вывод был также дополнительно доказан методами авторадиографии на клетках. Таким образом, в данной части работы была показана применимость метода фоточувствительных зондов для изучения молекулярных мишеней блок-сополимеров в клетках. (9) Исследование способности блок-сополимеров тирозина и этиленкосида восстанавливать золотохлористоводородную кислоту. Коллоидные частицы золота находят множество приложений в биосенсорных системах, катализе и терапии. Медицинские применения золотых наночастиц требуют их включения в биосовметимые носители, обеспечивающие возможность циркуляции в кровотоке и последующего выведения наночастиц. Амфифильные блок сополимеры этиленоксида и аминокислот являются эффективными носителями для подобных задач. Полиаминокислотный , в частности, политирозиновый, блок может связываться с металлическим золотом (гидрофобные взаимодействия), а полиэтиленоксидный блок способен стабилизировать частицы в растворе, а также обладает биосовместимостью. В связи с этим, в данной части работы мы исследовали возможность синтеза коллоидных частиц золота в реакции HAuCl4 с блок-сополимером этиленоксида и тирозина в водной среде и контролировать размер и свойства частиц с помощью изменения соотношения блоков в сополимере. Для проведения реакции синтезированные сополимеры диспергировали в воде путем 50-100-кратного разбавления раствора N,N-диметилформамиде водой, в результате чего образовывались мицеллы со средним гидродинамическим диаметром 20-1000 нм в зависимости от состава сополимера. Добавление HAuCl4 приводило к образованию коллоидных частиц золота, размер и форма которых зависели от состава блок-сополимера. Исследование полученных образцов с помощью УФ-спектроскопии и просвечивающей электронной микроскопии показало, что в присутствии блок-сополимеров с содержанием тирозина 20-40% формируются крупные тригональные золотые наночастицы размером 20-300 нм и характеризующиеся интенсивной полосой возбуждения поверхностных плазмонов. В присутствии сополимеров, содержащих 60-80% политирозина образуются частицы размером менее 2 нм, способные флуоресцировать. Такие частицы с несформированной зонной структурой называются золотыми нанокластерами и вызывают большой интерес в связи с возможностью их использования в биосенсорных системах. Таким образом, мы впервые показали возможность образования коллоидных частиц золота при взаимодействии HAuCl4 с блок-сополимерами этиленоксида и аминокислот, а также установили зависимость свойств получаемых частиц от состава сополимера. | ||
2 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Взаимодействие биоразлагаемых амфифильных блок-сополимеров на основе политирозина с липидными мембранами, низкомолекулярными лекарствами и раковыми клетками |
Результаты этапа: 1) Методами светорассеяния исследованы закономерности формирования ассоциатов блок-сополимеров политирозина и полиэтиленоксида. Тирозин является одной из наиболее гидрофобных аминоккислот, поэтому блок политирозина совершенно нерастворим в воде. Поэтому в врастворе блок-сополимеры агреируют и при высоком содержании тирозина (более 70% по массе) имеют тенденцию к выпадению в осадок. Однако при содержании тирозина в составе сополимера ниже 70% данные сополимеры образовывали устойчивые коллоидные системы в водном растворе. Для того, чтобы охарактеризовать ассоциаты, образуемые этими сополимерами в водном растворе, мы использовали методы динамического светорассеяния и просвечивающей электронной микроскопии. Комбинация этих методов необходима для характеристики ассоциатов, поскольку многие из исследованных сополимеров образовывали в воде вытянутые фибриллярные или стержнеобразные структуры. Оказалось, что образцы, содержащие короткие блоки политирозина (массовая доля около 35-40%) склонны к образованию вытянутых мицелл, причем сополимер pTyr17-PEG43 образовывал фибриллы длиной до 300 нм и толщиной 5-6 нм. Блок-сополимер, содержащий сходный по длине блок политирозина и более длинный блок полиэтиленоксида pTyr15PEG115 образовывал сходные по толщине, но более короткие стержни длиной около 100 нм. При этом трехблочные сополимеры, полученные из макроинициатора на основе полиэтиленоксида с молекулярной массой 20000 и двумя концевыми аминогруппами, образовывали лишь сферические частицы, различающиеся по размеру. Увеличение длины политирозина в двублочных сополимерах способствовало образованию сферических частиц. При этом промежуточное количество политирозина, соответствующее около 40-50% формировали короткие стержнеобразные мицеллы и крупные шарообразные частицы с оболочкой, имеющей повышенное сродство к контрастирующему агенту (вольфрамату натрия). Поскольку в качестве контрастирующего агента в наших опытах был использован вольфрамат натрия, способный образовывать с ПЭГ комплексы, стабилизированные координационными связями, можно предположить, что поверхность этих сферических частиц покрыта полиэтиленоксидом. Внешний вид и форма этих частиц указывает на их везикулярную природу. Дальнейшее увеличение содержания тирозина в двублочных и трехблочных сополимерах до 75-80% приводило к образованию препаратов сильно агрегирующих в водной среде. Эти полимеры образовывали частицы размером 80-100 нм, причем их оболочка не имела повышенного сродства к контрастирующему агенту. Это указывает на то, что повехность таких частиц не полностью покрыта цепями полиэтиленоксида, т.е. образующиеся частицы являются продуктом быстрого и неупорядоченного выделения полимера в фазу преципитата и по существу являются наночастицами. Вследствие низкого содержания ПЭГ в этих образцах образование мицелл или везикул невозможно, и полимер просто выделяется в нерастворимую фазу. Оказалось, что форма ассоциатов для некоторых образцов зависела от способа приготовления водных дисперсий. Поскольку препараты практически нерастворимы в воде, н хорошо растворимы в амидах (диметилформамиде, N-метилпирролидоне и формамиде), дисперсии полимеров готовили путем разбавления растворов полимеров в диметилформамиде (ДМФА). Исследование с помощью просвечивающей электронной микроскопии дисперсий полимера pTyr17-PEG43`, полученных путем 50-кратного разбавления водой растворов полимеров в ДМФА приводит к формированию, помимо фибриллярных частиц значительного количества (до 20%) широко распределенных по размеру сферических наночастиц. Предварительное разбавление раствора полимера в ДМФА водой в 10, 5 и 3 раза с последующим разведением полученных дисперсий, соответственно, в 5, 10 и 17 раз до конечной концентрации ДМФА 2% приводило к последовательному уменьшению доли сферических наночастиц в образце. Пи этом в образце, полученном путем 3-кратного разбавления с последующим разбавлением в 17 раз, наночастицы практически отсутствовали. В дисперсии содержались только фибриллярные структуры. Поскольку доля наночастиц в препарате зависит от способа его получения, можно заключить, что образование маленьких сферических наночастиц является для этого полимера следствием неравновесной нанопреципитации полимера. При резком ухудшении качества растворителя при быстром впрыскивании раствора в ДМФА в большой объем воды вероятность образования неравновесных структур макисимальна и увеличивается с ростом концентрации полимера. Напротив, при 3-кратном промежуточном разбавлении раствора в диметилформамиде формируются предшественники термодинамически стабильных фибрилл. Последующее 17-кратное разбавление приводит к образование стабильной нерасслаивающейся дисперсии, состоящей из длинных фибрилл, и практически не содержащей наночастиц. При этом дальнейшее количественное удаление диметилформамида из раствора с помощью диализа не изменяет морфологии и размеров содержащихся в нем частиц. Получение водной дисперсии путем диализа разбавленного раствора полимера в диметилформамиде против воды не позволяет избежать образования неравновесных структур. В то же время, по сравнению с нанопреципитацией, диализ обеспечивает 2-3-кратное снижение вероятности образования неравновесных структур при переводе полимера из диметилформамида в воду. По всей видимости, замена диметилформамида на воду в диализном мешке происходит слишком быстро и при незначительном изменении концентрации полимера. Очевидно, что положительным фактором при последовательном разбавлении полимера в 3 и 17 раз является одновременное понижение концентрации не только диметилформамида, но и самого полимера. Можно предполагать, что это способствует равновесной самоорганизации полимера с образованием наиболее устойчивых структур. Нами был также исследован еще один способ воздействия на структуру полимерных ассоциатов – обработка дисперсий ультразвуком. Оказалось, что воздействие на водную дисперсию ультразвуком с частотой 22 КГц в течение 9 минут (3х3 мин) приводит к незначительному уменьшению сферических везикулоподобных частиц в препаратах pTyr19-PEG115 и pTyr36-PEG43. Однако фибриллярные структуры длиной около 300-400 нм, образуемые рTyr17-PEG43 распадались на «иголкоподобные» частицы длиной около 50 нм, причем их поперечный размер оставался неизменным около 5-6 нм. Таким образом было показано, что, в зависимости от состава, блок-сополимеры тирозина и этиленоксида способны образовывать вытянутые фибриллоподобные мицеллы, везикулы или наночастицы. С помощью методов просвечивающей электронной микроскопии и динамического светорассеяния найден оптимальный способ получения водных дисперсий блок-сополимеров, состоящий в растворении полимеров в диметилформамиде, 3-кратном разбавлении данных растворов водой с последующим разбавлением раствора водой создает условия для равновесной самоорганизации полимера. 2) Исследованы возможности взаимодействия мицелл политирозина с доксорубицином и другими противоопухолевыми антибиотиками. Мицеллы блок-сополимеров тирозина и этиленоксида являются биодеградируемыми полимерами, поэтому могли бы использоваться в качестве носителей для доставки лекарств. Поэтому мы попытались нагрузить мицеллы доксорубицином. Для этого доксорубицин гидрохлорид был переведен в форму основания добавлением триэтиламина и растворен в хлористом метилене. Насыщенный раствор доксорубицина в хлористом метилене имел концентрацию около 0.3 мг/мл. Далее в этот раствор были добавлены растворы полимеров тирозина и этиленоксида pTyr17-PEG43, pTyr36-PEG43 и pTyr80-PEG43 в количестве, соответствующем 2-кратному молярному избытку полимера по отношению к доксорубицину. Данные смеси были эмульгированы в водно-солевом буферном растворе, после чего хлористый метилен удалили в вакууме и оставшийся раствор диализовали против водносолевого буфера с рН 7.4. Оказалось, что загрузка мицелл доксорубицином не превышает нескольких процентов, что сопоставимо с ошибкой эксперимента. Сходные результаты были получены и с полимерами других составов. Это может быть следствием двух причин. Наиболее простое объяснение состоит в том, что доксорубицин является относительно гидрофильной молекулой, посколку содержит аминогруппу, протонируемую при нейтральном рН. Поэтому в нейтральном растворе доксорубицин может легко перераспределяться в водную фазу. Тем не менее, это объяснение противоречит нескольким литературным источникам, в которых было показано, что доксорубицин может удерживаться в мицеллах некоторых амфифильных сополимеров. К сожалению, наши результаты не подтверждают данные этих авторов. Для того, чтобы изучить возможность включения в ассоциаты блок-сополимеров тирозина и этиленоксида более гидрофобных молекул мы исследовали солюбилизацию гидрофобного флуоресцентного зонда перилена. Эти измерения позволяют оценить объем гидрофобной фазы в мицеллах блок-сополимеров по сравнению с более глубоко исследованными мицеллами блок-сополимеров этиленоксида и пропиленоксида (плюроников). В экспериментах с периленом методом последовательных разбавлений были приготовлены дисперсии блок-сополимеров в водно-солевом буферном растворе в концентрации 1 мг/мл, к которым добавляли водный раствор перилена до конечной концентрации 0.1 мкМ. При перераспределении перилена из водного раствора в полимерные ассоциаты наблюдался батохромный сдвиг спектра флуоресценции и увеличение интенсивности флуоресценции в 2.5 раза. Влияние полимеров на спектр флуоресценции перилена увеличивалось с ростом длины гидрофобного блока, что отражает увеличение объема гидрофобной фазы в растворе сополимеров. При этом повышение концентрации полимеров нивелировало различия во флуоресценции между различными полимерами, и, независимо от длины гидрофобного блока, все полимеры повышали флуоресценцию перилена до одного и того же уровня. Для того, чтобы оценить масштаб изменения интенсивности флуоресценции перилена при солюбилизации в мицеллах полимерного ПАВ, мы сравнили его спектр флуоресценции в ассоциатах блок-сополимеров pTyr-PEG c его спектрами флуоресценции в мицеллах плюроника Р85 при такой же концентрации полимера. Оказалось, что флуоресценция перилена, солюбилизованного в мицеллах плюроника Р85, втрое превышает его флуоресценцию в мицеллах всех исследованных сополимеров. Это означает, что при одинаковой массовой концентрации и почти независимо от доли тирозина в блок-сополимере, объем гидрофобной фазы доступной для гидрофобного зонда в мицеллах pTyr-PEG оказывается втрое меньшим, чем в мицеллах плюроников. Таким образом, можно заключить, что мицеллы сополимеров pTyr-PEG могут солюбилизовать гидрофобные соединения, однако высокая упорядоченность цепей в таких мицеллах и высокая склонность этих сополимеров к образованию крупных ассоциатов сильно ограничивает возможность их загрузки гидрофобными соединениями. 3) Изучены особенности поведения блок-сополимеров, гидрофобный блок которых состоит из рацемической смеси изомеров тирозина. Мы предположили, что невысокая емкость ассоциатов, образуемых блок-сополимерами pTyr-PEG обусловлена чрезвычайно компактной упаковкой, стабилизированной, помимо гидрофобных взаимодействий, водородными связями между цепями политирозина. Эти водородные связи могут быть обусловлены формированием элементов вторичной структуры (скорее всего, бета-листов), сформированных упаковкой параллельно расположенных макромолекул сополимеров. Тогда можно предположить, что использование рацемической смеси L- и D-изомеров тирозина для синтеза блок-сополимеров pTyr-PEG может способствовать получению более компактных мицелл с менее плотной упаковкой цепей, и, следовательно, проявляющих более высокую солюбилизующую способность по отношению к гидрофобным соединениям. Синтез блок-сополимеров D,L-тирозина и этиленоксида проводили методом цепной полимеризации N-карбоксиангидрида D,L-тирозина, используя в качестве макроинициатора амино-терминированный полиэтиленоксид. Полученные полимеры содержали в среднем 18, 8 и 5 остатков тирозина и характеризовались индексом полидисперсности около 1.3. Оказалось, что свойства водных дисперсий полученных рацемических блок-сополимеров кардинально отличались от свойств блок-сополимеров на основе поли –L-тирозина. Блок-сополимеры, содержащие рацемический гидрофобный блок образовывали маленькие сферические мицеллы, размер которых линейно увеличивался с ростом длины гидрофобного блока. Ни фибриллярных, ни везикулярных структур в таких препаратах не наблюдалось. При этом данные, полученные методами динамического светорассеяния и просвечивающей электронной микроскопии практически совпадали. Исследование взаимодействия блок-сополимеров на основе поли-D,L-тирозина с модельными мембранами показало, что полученный сополимер способен встраиваться в липидный бислой с эффективным коэффициентом распределения около 150000 М-1, что сопоставимо с коэффициентами распределения гидрофобных блок-сополимеров этиленоксида и пропиленоксида. Исследование солюбилизации перилена в мицеллах блок-сополимеров, гидрофобный блок которых состоит из звеньев D,L-тирозина, показало, что утрата стереорегулярности не позволила увеличить солюбилизацию гидрофобного флуоресцентного зонда. 4) Исследовано влияние упаковки доксорубицина в мицеллах различных типов на его цитотоксичность по отношению к раковым клеткам. Для изучения количества доксорубицина, способного накопиться в мицеллах блок-сополимеров, различающихся длиной политирозинового блока, стереорегулярностью и наличием алифатических радикалов использовали два подхода. Первый из них состоял в растворении полимеров в диметилформаимиде, разбавлении этого раствора с раствором доксорубицина в хлористом метилене с последующим эмульгированием данного раствора в водно-солевом буфере. Далее хлористый метилен удаляли в вакууме роторного испарителя, обрабатывали получившуюся дисперсию ультразвуком и диализовали против водно-солевого буферного раствора. Другой подход состоял в совместном растворении доксорубицина и блок-сополимера в диметилформамиде в присутствии триэтиламина. Данный раствор разбавляли водным буферным раствором и диализовали против того же буфера. Оказалось, что доксорубицин не удерживается в мицеллах блок-сополимеров, независимо от длины их гидрофобного блока. Присоединение к N-концевой аминогруппе полимера остатков пальмитиновой кислоты также не позволило повысить сродство полимерных ассоциатов к доксорубицину. Единственный способ, который может помочь удержать доксорубицин в мицеллах блок-сополимеров - придание им анионного заряда за счет модификации гидроксильных групп остатками дикислот (щавелевой, янтарной или малеиновой). Эффективность данного подхода будет исследована на следующем этапе работы. 5) Исследованы закономерности взаимодействия блок-сополимеров с золотохлористоводородной кислотой. . Цель этой части работы состояла в исследовании закономерностей взаимодействия наночастиц золота с синтетическими полимерами. Большой материал, накопленный в этой области в последнее десятилетие, показывает, что золотые наночастицы могут эффективно использоваться для конструирования наноустройств, предназначенных для доставки противоопухолевых препаратов в раковые клетки. Несмотря на обширные данные литературы, касающиеся синтеза плазмонных частиц и золотых нанокластеров, проявляющих флуоресцентные свойства, и закономерности получения наночастиц в мицеллах блок-полипептидов остаются неисследованными. Было показано, что блок-сополимеры тирозина и этиленоксида образуют плотные мицеллы, стабилизированные, помимо гидрофобных взаимодействий, также межцепными водородными связями между пептидными группами. Поскольку тирозин способен восстанавливать золотохлористоводородную кислоту, данные мицеллы представляют собой удобную модель для исследования закономерностей получения металлических наночастиц в мицеллах полимеров, способных одновременно выполнять функцию стабилизаторов металлических наночастиц и восстановителей. Для изучения закономерностей восстановления золотохлористоводородной кислоты в мицеллах блок-полипептидов мы варьировали соотношение Tyr/НAuCl4 и следовали за кинетикой расходования HAuCl4 и появлению плазмонных частиц с помощью УФ-спектроскопии. С этой целью стабильные дисперсии сополимеров готовили при постоянной концентрации звеньев тирозина (3,3 мМ) и смешивали с 6,6, 2,2 и 0,67 мМ HAuCl4. Основываясь на литературе, касающейся химического [Warren J.J., Winkler J.R., Gray H.B. FEBS Lett. 2012, 586, 596–602.] или электрохимического [Malfoy B., Reynaud J.A. Electrochemical investigations of amino acids at solid electrodes. J. Electroanal. Chem. Interfacial Electrochem. (1980) 114, 213-223] окисления тирозина можно ожидать, что в процессе взаимодействия с тетрахлорауратом он отдает один электрон и протон с образованием феноксильных радикалов в нейтральной или слабокислой среде. В этом случае восстановление тетрахлораурата должно происходить со стехиометрией, соответствующей окислению 3 молей остатков Tyr на 1 моль восстановленного золота. Для оценки стехиометрии восстановления Tyr тетрахлорауратом был выбран образец, содержащий самый короткий блок pTyr (pTyr6-PEG43) и самую низкую концентрацию хлористоводородной кислоты. По данным УФ-спектроскопии такие условия приводили к расходованию почти 93% тетрахлораурата в ходе реакции. Для количественной оценки количества потребляемого тирозина был использован аминокислотный анализ. Оказалось, что отношение количества тирозина, израсходовавшегося в ходе реакции, к количеству накопленного металлического золота составляло примерно 3,09+/-0,17. Этот результат указывает на то, что в условиях эксперимента (нейтральный или слабокислый pH, комнатная температура Tyr окисляется с по механизму одноэлектронного переноса в полном соответствии с вольтамперометрическими данными, полученными ранее Малфоем и Рейно [Malfoy B., Reynaud J.A. Electrochemical investigations of amino acids at solid electrodes. J. Electroanal. Chem. Interfacial Electrochem. (1980) 114, 213-223]. В то же время ионы AuCl4 принимают 3 электрона, поэтому каждый моль тетрахлораурата окисляет 3 моля остатков Tyr в мицеллах сополимера. С учетом определенной нами стехиометрии взаимодействия сополимеров тирозина и этиленоксида с тетрахлорауратом концентрации HAuCl4 равные 6.6 и 2.2 мМ соответствуют6 и 2-кратному избытку золотохлористоводородной кислоты, а концентрация равная 0.67 мМ - соответствует 1.5-кратному избытку тирозина по отношению к содержанию тетрахлораурата. Добавление HAuCl4 к сополимеру приводило к постепенному снижению интенсивности полос поглощения при 313 и 277 нм, которые отвечали, соответственно, тетерахлораурату и тирозину. Полоса при 277 нм практически незаметна в образцах с концентрацией HAuCl4 6.6 мМ на фоне сильного поглощения тетрахлораурата при 313 нм. Важно, что вплоть до окончания реакции в этих образцах практически не появлялось полосы поглощения в области 500-700 нм, соответствующей поверхностным плазмонам. Напротив, восстановление терахлораурата в образцах, содержащих 5-кратный избыток тирозина, сопровождалось появлением отчетливых плазмонных полос поглощения при 560 и 750 нм. Сходные, но менее отчетливые полосы поглощения наблюдались в образцах, содержащх 1.5-кратный избыток тирозина. Изменение окраски образцов в ходе восстановления также свидетельствовало об уменьшении желтой окраски тетрахлораурата и появлению красных или синих наночасти, причем эти изменения сильно зависели от мольного соотношения Tyr/HAuCl4 в образце, а состав полимера влиял на эти изменения лишь незначительно. Кинетика расходования тетрахлораурата в образцах подчинялась кинетике первого порядка в соответствии с предыдущими данными [Baby Nirmala N., Vani P. Int. J. Sci Res. 2013, 2, 25-27]. Кажущаяся константа скорости первого порядка расходования HAuCl4 составляла около 0,7+/-0,2 ч-1 во всех образцах и не зависела от длины блока pTyr в сополимере. Исключение составлял образец pTyr67-PEG43 при низкой концентрации HAuCl4, который образовал осадок красновато-синего цвета в результате окисления в течение первого часа. Быстрое осаждение этого сополимера, по всей видимости, вызывало почти двукратное ускорение потребления тетрахлораурата. Однако глубина восстановления зависела как от отношения Tyr / HAuCl4, так и от состава полимера и формы образованных им частиц. Так, увеличение мольного соотношения Tyr / HAuCl4 от 0,5 до 5 приводило к более чем 5-кратному увеличению степени восстановления в случае сополимера с самым коротким гидрофобным блоком (pTyr6-PEG43). В то же время в случае сополимеров pTyr17-PEG43 и pTyr67-PEG43 эта величина также увеличилась, но только в три раза. Роль состава сополимера еще более отчетливо проявляется при анализе молярного отношения восстановленного тетрахлораурата к содержанию тирозина в сополимере. Этот параметр показывает степень загрузки полимерных мицелл наночастицами золота. Хотя исходное молярное отношение HAuCl4 / Tyr было одинаковым для всех сополимеров, нагрузка мицелл наночастицами золота уменьшалась с ростом блока pTyr, что указывает на ограничения проникновения AuCl4- в плотные мицеллы сополимера. В случае сополимера pTyr6-PEG43 отношение Tyr / Au находится в пределах погрешности эксперимента, близкой к стехиометрии реакции, оцененной выше, показывая, что почти все остатки тирозина в фибриллярных мицеллах этого сополимера участвуют в восстановлении тетрахлораурата. Значительное снижение отношения Au / Tyr для более гидрофобных полимеров указывает на ограниченную доступность их мицелл для ионов тетрахлораурата. Полученные закономерности легко объяснить, рассмотрев трехстадийный механизм. Как следует из недавних теоретических расчетов, выполненных Toroz и Corni с помощью теории функционала плотности [Toroz D., Corni S. Nano Lett. 2011, 11, 1313–1318.], остатки Tyr в полипептидах эффективно связывают ионы тетрахлораурата. Следовательно, на первом этапе должна происходить быстрая адсорбция ионов тетрахлораурата на мицеллах pTyr-PEG. Дальнейшее окисление тирозина с образованием феноксильных радикалов приводит к образованию мелких зерен металлического золота. Если процесс происходит в присутствии большого избытка сополимера (низкая концентрация тетрахлораурата), эти зародыши растут либо за счет слияния, либо вследствие поступления несвязанного хлораурата из раствора. В этих условиях длина блока pTyr оказывает сильное влияние на глубину восстановления тетрахлораурата. В случае сополимера pTyr-PEG43, который образует фибриллярные мицеллы, ионы тетрахлораурата могут легко взаимодействовать почти со всеми остатками Tyr. Поэтому выход восстановления просто определяется молярным избытком восстановителя. Увеличение длины блока pTyr до 17 или 67 остатков приводит к образованию плотных сферических наночастиц. Значительная доля остатков Tyr недоступна для ионов тетрахлораурата в этих наночастицах, поэтому выход восстановления уменьшается с длиной гидрофобного блока. Анализ размера наночастиц, образовавшихся в мицеллах всех исследованных сополимеров pTyr-PEG при отношении Tyr / Au = 0,5, выявил присутствие очень маленьких наночастиц с размером около 3-10 нм. В этих образцах не было частиц размером более 20 нм, что свидетельствует об удовлетворительном контроле синтеза наночастиц золота в этих условиях. Увеличение соотношения Tyr / Au до 2 приводило к образованию крупных широко распределенных тригональных и гексагональных нанопластинок со средним диаметром около 50 нм. Однако в этих образцах также образовалось значительное количество мелких наночастиц с центром около 10 нм, что позволяет предположить, что старение зародышей в присутствии избыточного количества тирозина может быть причиной образования крупных нанопластинок. Широкое распространение этих нанопластинок указывает на стохастический характер роста зародышей. Очевидно, что степень этого роста определяется доступностью неокисленных остатков Tyr в окрестности зародыша. Поскольку распределение полученных наночастиц по размерам достаточно широкое, можно предположить, что анализ образцов методом электронной микроскопии может вносить искажения, связанные с приготовлением образца: соотношение частиц разных размеров в образце может отличаться от его величины в растворе. Поэтому для дополнительного подтверждения обнаруженных различий мы исследовали спектры поглощения полученных препаратов в области поглощения поверхностных плазмонов после отделения непрореагировавшего тетрахлораурата. Оказалось, что плазмонные свойства золотых наночастиц в расчете на один атом золота значительно возрастают с увеличением соотношения Tyr/Au и слабо увеличиваются при увеличении содержания тирозина в составе сополимера. Это означает, что в условиях недостатка восстановителя в мицеллах формируются маленькие золотые наночастицы, характеризующиеся невысоким коэффициентом экстинкции. В то же время восстановление терахлораурата в условиях избытка тирозина приводит к образованию больших плоских плазмонных частиц, характеризующихся высокой длиной волны поглощения и большим коэффициентом экстинкции. Выводы 1. В зависимости от состава, блок-сополимеры тирозина и этиленоксида способны образовывать вытянутые фибриллоподобные мицеллы, везикулы или наночастицы. С помощью методов просвечивающей электронной микроскопии и динамического светорассеяния найден оптимальный способ получения водных дисперсий блок-сополимеров, состоящий в растворении полимеров в диметилформамиде, 3-кратном разбавлении данных растворов водой с последующим разбавлением раствора водой создает условия для равновесной самоорганизации полимера. 2. Ни один из исследованных сополимеров не способен связывать доксорубицин в количествах достаточных для использования в экспериментах на культурах клеток. 3. Ассоциаты блок-сополимеров pTyr-PEG способны солюбилизовать гидрофобный флуоресцентный зонд перилен. В то же время эффективность солюбилизации перилена в ассоциатах блок-сополимеров pTyr-PEG втрое меньше его солюбилизации мицеллами плюроников. 4. Физикохимические свойства ассоциатов, образуемых блок-сополимерами тирозина и этиленоксида, чувствительны к тому, построен ли их гидрофобный блок из оптически активного L-изомера аминокислоты, или из рацемической смеси L- и D-изомеров. Блок-сополимеры, содержащие оптически неактивный гидрофобный блок образуют маленькие сферические частицы. Однако их способность солюбилизовать перилен не отличается от сополимеров, образованных аналогичными по составу сополимерами, имеющими оптически активный гидрофобный блок. 5. Золотохлористоводородная кислота способна восстанавливаться блок-сополимерами pTyr-PEG c образованием золотых наночастиц, количества, размер и плазмоннце свойства которых контролирются как длиной блока политирозина, так и соотношением «тирозин:тетрахлораурат». | ||
3 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Взаимодействие биоразлагаемых амфифильных блок-сополимеров на основе политирозина с липидными мембранами, низкомолекулярными лекарствами и раковыми клетками |
Результаты этапа: 1. Солюбилизация доксорубицина в мицеллах пТир-ПЭГ Солюбилизация доксорубицина в мицеллах пТир-ПЭГ была исследована с помощью флуоресцентной спектроскопии. Для этого 0.5 мМ раствор доксорубицина в диметилформамиде смешивали с равным объемом раствора пТир-ПЭГ различной концентрации, после чего разбавляли в 50 раз водой и измеряли флуоресценцию доксорубицина. Оказалось, что по мере увеличения концентрации блок-сополимера пТир6-ПЭГ43 спектр флуоресценции доксорубицина не менялся, однако в присутствии блок-сополимера с более длинным гидрофобным блоком пТир17-ПЭГ43 наблюдался рост соотношения интенсивностей при 550 и 580 нм, что указывает на солюбилизацию доксорубицина в мицеллах данного блок-сополимера. Аналогичный результат наблюдался и в присутствии блок-сополимера пТир36-ПЭГ115, а также трехблочного сополимера пТир15-ПЭГ454-пТир15. Блок-сополимеры с более длинным гидрофобным блоком не были эффективны в солюбилизации доксорубицина вследствие низкой растворимости в воде. Измерение коэффициентов распределения доксорубицина между водной фазой и мицеллами блок-сополимеров проводили как описано в нашей ранее опубликованной работе [ ]. Оказалось, что наибольшим сродством доксорубицин обладал к мицеллам сополимера пТир36-ПЭГ115. (рис. 1)При этом коэффициент распределения для этого сополимера составил 450 что отвечает связыванию в мицеллах приблизительно 26% содержащегося в растворе доксорубицина при концентрации полимера 1 мг/мл. Рис. 1. Зависимость I(560)/I(580) в спектрах флуоресценции доксорубицина от концентрации блок-сополимеров пТир17-ПЭГ43 (1), пТир36-ПЭГ115 (2) и пТир15-ПЭГ454-пТир15 (3). Совершенно очевидно, что коэффициент распределения порядка сотен не может обеспечить необходимую для биологических экспериментов устойчивость комплексов лекарства с полимером. Поэтому мы рассмотрели возможность модификации блок-сополимеров дикислотами для придания блок-сополимерам избыточного отрицательного заряда. Поскольку боковая цепь тирозина содержит ароматическую гидроксмльную группу, ее можно модифицировать хлорангидридами кислот с образованием сложных эфиров. Известно, что сложные эфиры тирозина с малеиновой , метилмалеиновой или диметлмалеиновой кислотами не стабильны. Однако увеличение или уменошение развязки между карбоксилами увеличивает стабильность сложных эфиров. Ацилирование тирозина в составе блок-сополимера проводили избытком оксалилхлорида в течение 2 часов при 0 - +4оС в N,N-диметилформамиде в качестве растворителя и пиридине в качестве основания, связывающего выделяющийся хлористый водород. После окончания реакции реакционную смесь осторожно разбавляли в 3-4 раза безводным диэтиловым эфиром и выпавший хлоргидрат пиридиния удаляли с помощью центрифугирования. Далее полимер выделяли двукратным разбавлением образцов диэтиловым эфиром и полимер отделяли центрифугированием. Осадок промывали несколько раз эфиром и высушивали осадок от следов эфира в вакуумном сушильном шкафу. Далее полимеры растворяли в воде, диализовали в течение 3-4 часов и растворы лиофилизовали. Степень модификации полимеров определяли с помощью кислотно-основного титрования (Таблица 1.) Оказалось, что модификация блок-сополимеров избытком оксалилхлорида привела к модификации 40-80% тирозиновых групп. Таблица 1. Сополимер Избыток Степень модификации Степень связывания доксорубицина -NaCl +NaCl пТир17-ПЭГ43 2 30% 25% 2% пТир17-ПЭГ43 5 63% 67% 15% пТир36-ПЭГ43 2 32% 28% 1.5% пТир36-ПЭГ43 5 78% 70% 3% Прибавление полученных сополимеров к 50 мкМ раствору доксорубицина в 10мМ фосфатном буфере в отсутствие дополнительной соли приводило к значительному снижению флуоресценции доксорубицина. Это очевидно связано с формированием электростатических комплексов доксорубицина с полученными сополимерами. При этом в таком взаимодействии очевидно участвуют практически все введенные в сополимер анионные группы. Повторение этого эксперимента в присутствии физиологической концентрации NaCl (0.15 М) привело к резкому снижению влияния полимеров а флуоресценцию доксорубицина. Этот результат однозначно свидетельствует о том, что в присуствии физиологической концентрации соли ионные взаимодействия между оксалилтирозином и доксорубицином ослабляются, причем комплексы между полимером и лекарством практически не образуются. Данный результат согласуется с показанными нами ранее особенностями формирования комплексов доксорубицина с гидрофобизованными акриловыми кислотами. [ ] По всей видимости, гидрофобность доксорубицина в заряженной форме слишком мала, чтобы способствовать удерживанию лекарства в комплексе с амфифильным полимером в условиях экранирования анионных зарядов сополимера. Другая вероятная причина низкой стабильности комплексов доксорубицина с оксалилполитирозином в физиологических условиях состоит в существенном снижении гидрофобности блок-сополимеров при их ацилировании остатками щавелевой кислоты. Введение анионного заряда на каждое третье или второе звено гидрофобнго блока сополимера существенно понижает его гидрофобность, поэтому такие полимеры значительно слабее агрегируют. Следовательно, взаимодействие доксорубицина с сополимерами оказывается в основном электростатическим и поэтому дестабилизируется в физиологических условиях. Цитотоксичность комплексов доксорубицина с блок-сополимерами исследовать смысла не было, поскольку в физиологических условиях комплексы практически сразу разрушаются. 2. Ранее в нашей лаборатории были сконструированы эмульсионные нанореакторы для проведения пероксиоксалатной хемилюминесцентной реакции между ароматическими эфирами щавелевой кислоты и перекисью водорода, состоящие из органического растворителя (диметилфталата), в котором растворяли полимерный оксалат и тетраметилгематопорфирин (ТМГП), стабилизированные плюроником L64. [ ] Было показано, что в присутствии пероксида водорода такие частицы способны вступать в пероксиоксалатную реакцию с излучением света. Присутствие ТМГП в нанореакторах позволяло не только регистрировать свет, но и генерировать синглетный кислород. Было показано, что описанные нанореакторы могут использоваться для уничтожения раковых клеток в состоянии окислительного стресса. (Рис. 2) Рис. 2. Описание подхода хемилюминесцентной фотодинамической терапии согласно [3]. (а) Схема пероксиоксалатной хемилюминесцентной реакции между ароматическими оксалатами и пероксидом водорода, которая в присутствии полициклических молекул сопровождается излучением света. ВЭИ – выскоэнергетический интермедиат (1,2-диоксетан дион). (б) Полимерный оксалат, использованный в нашей предыдущей работе, и состоящий из бисфенола А, олигопропиленоксида и остатков щавелевой кислоты. (в) Строение эмульсионных наноконтейнеров. (г) Схема превращений в эмульсионных наноконтейнерах при контакте с пероксидом водорода, заканчивающихся генерацией синтглетного кислорода. Описанная система была сконструирована из компонентов, которые не являются биосовместимыми, и поэтому не могут использоваться для получения лекарственных форм. В настоящей работе мы попытались сделать следующий шаг в качестве нанореакторов использовать полипептиды – блок сополимеры тирозина и этиленоксида. Для придания этим полимерам способности вступать в пероксиоксалатную хемилюминесцентную реакцию необходимо ввести в них оксалатные группы, которые могут выполнять роль сшивок. Подходы к получению таких материалов в литературе не описаны, поэтому в настоящей работе было проведено исследование реакции политирозина с оксалилхлоридом и изучены закономерности формирования межцепных оксалатных групп в мицеллах таких сополимеров. Как видно из данных, показанных на рис.3в), разбавление реакционной смеси при постоянстве соотношений ТГФ/пиридин=1:1 и оксалилхлорид/тирозин=1:2 действительно влияет на способность полученного политирозиноксалата вступать в ПО-реакцию. В качестве меры этой способности мы использовали интегральную интенсивность излученной хемилюминесценции нормированную на молярную концентрацию звеньев тирозина в образце. Оказалось, что понижение концентрации полимера от 80 до 10 мг/мл приводит к увеличению этого параметра, а дальнейшее понижение концентрации полимера в процессе сшивания почти полностью препятствует эффективному образованию диоксалатных групп (Рис.3в) Можно предположить, что этот эффект объясняется присутствием следов воды в используемых растворителях, вследствие чего понижение концентрации тирозина сдвигает баланс между реакциями ацилирования тирозина и гидролиза хлорангидрида в сторону последнего. . Рис. 3. Влияние концентрации полимера в процессе его сшивания оксалилхлоридом на способность политирозиноксалата вступать в пероксиоксалатную хемилюминесцентную реакцию с перекисью водорода. Кинетика излучения света в процессе реакции полимеров, полученных в результате сшивания пТир45-ПЭГ43 при концентрации 80 мг/мл (а) и 10 мг/мл (б) мг/мл в смеси ТГФ/пиридин (1:1) при добавлении эквимольного количества оксалилхлорида. (в) Сравнение эффективности политирозиноксалатов, синтезированных в растворах с различной конечной концентрацией. На оси ординат показана интегральная интенсивность света, излученного в ходе ПО-реакции, Q, нормированная на концентрацию звеньев тирозина в образце. Измерения проведены в буфере 0.01 М Na2HPO4, 0.15 M NaCl при концентрации полимера 0.5 мг/мл, перекиси водорода 18 мМ, перилена – 0.16 мМ, имидазола – 25 мМ, 37oC. Низкое содержание диоксалатных звеньев в образце, полученном при концентрации полимера 1 мг/мл, подтверждается также зависимостью хемилюминесцентного сигнала от концентрации перекиси водорода. Как показано на рис.4 препарат, полученный при концентрации полимера 1 мг/мл, вообще не дает хемилюминесценции. В то же время, препарат, полученный при концентрации 10 мг/мл, дает удовлетворительный хемилюминесцентный сигнал, зависящий от концентрации пероксида водорода. .Рис. 4. Зависимость интенсивности хемилюминесценции, излученной в результате ПО-реакции между Н2О2 и политирозиноксалатами, полученными при сшивании пТир45-ПЭГ52 при 10 мг/мл (1) и 1 мг/мл (2), от концентрации перекиси водорода. Данные получены при концентрации полимера 2 мг/мл, перилена – 0.16 мМ, имидазола – 25 мМ с помощью плашечного люминометра Victor (Perkin-Elmer) при накоплении сигнала в течение 10 с при комнатной температуре. Полученные результаты указывают на то, что эффективность хемилюминесценции политирозиноксалата может ограничиваться двумя факторами: во-первых, неограниченное сшивание полимера в концентрированном растворе приводит к образованию нерастворимых продуктов и, во-вторых, проведение реакции в разбавленном растворе вообще неэффективно, по всей видимости, вследствие наличия следов воды в используемых растворителях. По мере увеличения объема растворителя, при сохранении количества добавляемого хлорангидрида, количество воды в системе может стать близким количеству добавляемого оксалилхлорида. А это будет понижать эффективность образования диоксалатных групп, вступающих в ПО-реакцию. Фактор наличия в системе избыточных количеств воды можно было бы скомпенсировать, добавляя повышенные по сравнению с эквимольными количества оксалилхлорида, однако, как следует из рис.5, это также понижает эффективность образования диоксалатных групп. По всей видимости, в этом случае увеличивается доля моно-замещенных эфиров щавелевой кислоты, которые не вступают в ПО-реакцию с перекисью водорода. Рис.5. Влияние молярного избытка оксалилхлорида по отношению к звеньям тирозина в составе сополимеров пТир45-ПЭГ52 (1) и пТир10-ПЭГ260-пТир10 (2) на интегральную интенсивность хемилюминесценции, излучаемой продуктом реакции при его взаимодействии с пероксидом водорода. Измерения проведены в буфере 0.01 М Na2HPO4, 0.15 M NaCl при концентрации полимера 0.55 мг/мл, перекиси водорода 18 мМ, перилена – 0.16 мМ, имидазола – 25 мМ, 37oC. Учитывая, что политирозин является достаточно жесткой макромолекулой вследствие ограничения вращения вокруг амидной связи, можно предполагать, что при реакции с оксалилхлоридом образование диоксалатных фрагментов может требовать значительного времени. Поэтому мы исследовали кинетику появления диоксалатных фрагментов в процессе реакции политирозина с оксалилхлоридом. Оказалось, что способность образующегося в ходе этой реакции полимера вступать в ПО-реакцию с пероксидом водорода развивается достаточно медленно. Как правило, реакция низкомолекулярных фенолов с оксалилхлоридом в аналогичных условиях заканчивается за 1-2 часа. Рис.6. Кинетика образования диоксалатных фрагментов в процессе реакции блок-сополимера пТир10-ПЭГ260-пТир10 с оксалилхлоридом в смеси ТГФ/пиридин 1:1 при концентрации тирозиновых остатков в реакционной смеси 0.1 М, концентрации оксалилхлорида 0.07М. Продукт реакции выделяли осаждением в гексан, растворяли в безводном диметилфталате в концентрации 125 мг/мл. Для измерения хемилюминесценции 0.01 мл этого раствора смешивали с 4 мг плюроника L64 и 20 мкл 16 мМ рствора перилена в кювете флуориметра, суспендировали в 1.5 мл буферного раствора (10 мМ Na2HPO4, 0.15 M NaCl, pH 7.4). Реакцию запускали инжектированием 0.5 мл того же буфера с пероксидом водорода и имидазолом. Конечная концентрация имидазола и Н2О2 соответственно 18 мМ и 25 мМ. Однако при сшивании политирозина с помощью оксалилхлорида диоксалатные фрагменты образовывались в течение, по меньшей мере, 10 часов (рис. 6). Это свидетельствует о том, что полимерная природа политирозинового блока сильно влияет на кинетику, а возможно, и эффективность его реакции с оксалилхлоридом. Можно ожидать, что при реакции оксалилхлорида с политирозином образуются полимерные частицы коллоидных размеров. Для доказательства образования сшивок между полимерными цепями мы применили методом динамического светорассеяния. Однако исследование гидродинамических размеров частиц в селективном растворителе, например, в воде, не может служить доказательством образования сшивок между полимерными цепями. Если же частицы будут наблюдаться в неселективном растворителе, это будет означать, что оксалилхлорид сформировал межцепочечные связи между полимерными макромолекулами. Действительно, оказалось, что в диметилсульфоксиде, являющимся хорошим растворителем для обоих блоков, наблюдаются частицы со средним гидродинамическим радиусом около 100 нм (рис. 7). Рис. 7. Анализ методом динамического светорассеяния политирозиноксалатного наногеля, полученного из блок-сополимера пТир10-ПЭГ260-пТир10, при его диспергировании в неселективном растворителе диметилсульфоксиде. Итак, в настоящей работе впервые показано, что блок-сополимеры тирозина и этиленоксида могут образовать полимерные сшитые наночастицы при реакции с оксалилхлоридом. В присутствии перекиси водорода и перилена в качестве активатора данные частицы вступают в пероксиоксалатную хемилюминесцентную реакцию с излучением света. Влияние структуры сополимеров политирозина и этиленоксида на хемилюминесцентные свойства образуемых ими политирозиноксалатных частиц. Полученные в настоящей работе наногели политирозиноксалата очевидно, могли бы представлять интерес для создания хемилюминесцентных сенсоров на пероксид водорода и для разработки подходов к химически-индуцированной фотодинамической терапии. Однако полученные системы достаточно слабо чувствительны к низким концентрациям пероксида. Возникает вопрос, можно ли управлять чувствительностью наногелей к перекиси водорода за счет изменения структуры блок-сополимера. С этим вопросом тесно связан и вопрос о влиянии строения блок-сополимеров и, в первую очередь, степени полимеризации политирозинового блока, на эффективность ПО-реакции с участием полученных на их основе политирозиноксалатных наногелей. Для изучения влияния степени полимеризации в настоящей работе был впервые синтезирован низкомолекулярный аналог политирозиноксалата. В качестве фенольного компонента был выбран метиловый эфир N-бензоил-L-тирозина (БТМЭ). Для измерения эффективности ПО-реакции с использованием данного соединения мы использовали ранее разработанную в нашей лаборатории эмульсионную систему, основанную на включении оксалата в эмульсию диметилфталата в воде, стабилизированную плюроником L64 [3]. Оказалось, что низкомолекулярный оксалат заметно более эффективен, чем политирозиноксалат Рис. 8. Кинетика испускания света в ходе ПО-реакции с участием низкомолекулярного БТМЭ-оксалата (1) и политирозиноксалата, полученного на основе триблок-сополимера пТир10-ПЭГ260-пТир10. Для измерения хемилюминесценции 0.01 мл этого раствора смешивали с 4 мг плюроника L64 и 20 мкл 16 мМ рствора перилена в кювете флуориметра, суспендировали в 1.5 мл буферного раствора (10 мМ Na2HPO4, 0.15 M NaCl, pH 7.4). Реакцию запускали инжектированием 0.5 мл того же буфера с пероксидом водорода и имидазолом. Конечная концентрация имидазола и Н2О2 соответственно 18 мМ и 25 мМ. В то же время, политирозиноксалат характеризуется значительно более медленным испусканием света в ходе ПО-реакции, что свидетельствует о значительном влиянии сетчатой структуры политирозиноксалата на его взаимодействие с перекисью водорода и периленом, используемым в качестве активатора. Это наблюдение указывает на то, что повышение длины политирозинового блока должно приводить к уменьшению эффективности ПО-реакции, одновременно увеличивая продолжительность ПО-реакции в водной среде. Для проверки этого вывода мы сравнили эффективность ПО-реакции с участием политирозиноксалатных наногелей, полученных из блок-сополимеров с различной длиной политирозинового и этиленоксидного блоков. Как и в предыдущих экспериментах, в качестве меры эффективности ПО-реакции мы использовали интегральную интенсивность хемилюминесценции, нормированную на концентрацию тирозина в образце. Рис. 9. Влияние структуры сополимеров тирозина и этиленоксида на эффективность ПО-реакции с участием образуемых ими политирозиноксалатных наногелей. На оси ординат показана интегральная эффективность хемилюминесценции, измеренная в стандартных условиях, и нормированная на молярную концентрацию звеньев тирозина. Условия измерения хемилюминесценции показаны в подписи к Рис.8. Как видно из диаграммы, показанной на рис. 9, активность политирозиноксалатных наногелей уменьшалась с ростом длины политирозинового блока. При этом наибольшая активность наблюдалась для трехблочного сополимера пТир15-ПЭГ454-пТир15, в котором короткие политирозиновые блоки разделены в макромолекуле длинной полиэтиленоксидной цепью. Можно предположить, что пониженная активность в ПО-реакции наногелей, полученных из сополимеров с длинными политирозиновыми блоками обусловлена высокой жесткостью полипептидной цепи, которая препятствует эффективному сшиванию боковых цепей тирозина. По всей видимости, в таких макромолекулах эффективная подстройка тирозиновых остатков сильно затруднена, что препятствует образованию максимально возможного количества диоксалатных групп. В результате этого при обработке оксалилхлоридом в полимере остается много монооксалатных групп, которые не активны в ПО-реакции. Не исключено также, что существенное значение для активности политирозиноксалата имеет также структура образуемых им мицеллярных агрегатов, которая в настоящей работе не была подробно исследована. В дальнейшем планируется развитие этой работы с целью оптимизации структуры политирозинового предшественника политирозиноксалатных наногелей и подробное исследование структуры образуемых им мицеллярных агрегатов в условиях проведения реакции ацилирования оксалилхлоридом. 3. Изучение мицелл блок-сополимеров методом флуоресцентной спектроскопии Известно, что тирозин обладает характерной полосой флуоресцнции при возбуждении на длине волны максимума, соответствующего n* переходу в боковой цепи тирозина. Этот переход отчасти (наряду с флуоресценцией индольного цикла триптофана) определяет флуоресценцию природных белков. При исследовании спектров флуоресценции водных растворов блок-сополимеров тирозина и этиленоксида мы обнаружили, что полоса флуоресценции сдвигается при увеличении длины волны возбуждения (рис. 10а). При этом стоксов сдвиг, рассчитанный в нм, увеличивался с ростом длины волны возбуждения. Сдвиг полосы испускания относительно возбуждающего света, выраженный в единицах энергии (эВ или см-1), остается неизменным с варьированием возбуждающей длины волны и составлял около 6000 см-1 или 0.8 эВ. Данная картина была одинакова для сополимеров, содержащих 7 или 67 звеньев политирозина. В то же время, растворение сополимеров в 0.1 М NaOH, сопровождающееся депротонированием гидроксильной группы политирозина, полностью нивелировало это явление: с ростом длины волны возбуждения в этих условиях полоса флуоресценции тирозина просто уменьшалась, и новых сигналов в спектре флуоресценции не возникало. Эти данные указывают на то, что наблюдаемое явление соответствует комбинационному рассеянию, отвечающему колебательно-вращательным уровням энергии блок-сополимеров. В то же время, в отличие от классических спектров КР, в данных экспериментах частота, соотвествующая поглощению возбуждающего света полимерными макромолекулами чрезвычайо велика: как правило, спектры КР по частотному диапазону соответствуют диапазону 600-4000 см-1. Частота, равная 6000 cм-1 или 0.8 эВ скорее близка к возбуждению низкоэнергетического электронного перехода, а не колебательно-вращательных уровней. Рис. 10. Влияние длины волны возбуждения на положение полосы флуоресценции в спектрах пТир6-ПЭГ. (а) Спектры флуоресценции при различных длинах волн возбуждения (показаны на графике). (б) Интенсивность флуоресценции как функция сдвига между волновым числом возбуждающего излучения и волновым числом регистрации сигнала (Рамановский сдвиг, см-1). Тот факт, что данный эффект чувствителен к рН, т.е. к степени протонирования тирозина может указывать на то, что данные колебания отвечают коллективным колебаниям ассоциатов политирозина. В щелочной среде политирозин становится полианионом и образует в воде истинный раствор. Можно полагать, что именно вследствие разрушения межцепных контактов коллективные колебания ассоциатов политирозина перестают возбуждаться в видимом спектральном диапазоне. Очевидно, что подробное исследование данного явления выходит далеко за рамки настоящего проекта. Тем не менее, мы полагаем, что данный интригующий результат требует дальнейшего всестороннего исследования. Насколько нам известно, данное явление, неизвестно для природных белков. 4. Каталитические свойства наночастиц золота, полученных в мицеллах блок-сополимеров тирозина и этиленоксида. Хорошо известно, что наночастицы золота могут катализировать различные процессы, сопровождающиеся переносом электронов, такие как восстановление [ ], окисление [ ], активация алкенов и алкинов [ ]. Золотые катализаторы используются в таких важных промышленных процессах, как гидрохлорирование ацетилена с целью получения винилхлорида и производство винилацетата из этилена и уксусной кислоты в присутствии кислорода [ ]. Известно, что наночастицы металлов катализируют гидрирование различных нитросоединений [ ]. В настоящей работе мы проверили каталитические свойства образующихся наночастиц, используя ранее описанную реакцию 4-нитрофенольного восстановления борогидридом натрия. В работе были использованы образцы наночастиц, синтез которых был оисан в предыдущих отчетах. Краткое описание этих образцов приведено в таблице 2. Таблица 2. Описание композитов и каталитические константы, рассчитанные по уравнению 5. № Рn(Tир) С( Au)/C(Тир) D, нм С( Au в ком- S, м2/л kcatS, м2моль-1с-1 позите),мкМ 1 6 2 7.96 635±5 0.0320.003 4.87±0.72 2 17 2 8.8 482±4 0.0360.003 7.19±0.21 3 67 2 7.50 309±2 0.0340.003 5.39±0.42 4 6 0.67 8.12 674±6 0.0250.003 3.26±0.24 5 17 0.67 8.00 602±6 0.0320.003 2.35±0.48 6 67 0.67 6.95 556±5 0.0370.004 3.22±0.33 7 6 0.2 18.82 581±5 0.0170.004 2.10±0.63 8 17 0.2 22.79 713±6 0.0230.004 2.16±0.47 9 67 0.2 21.28 557±5 0.0190.004 1.65±0.10 На рис. 11а показано снижение концентрации 4-нитрофенола за счет восстановления 30 мМ борогидридом натрия, катализируемого композитом pTyr-PEG@Au, полученному при восстановлении 6.7 мМ HAuCl4 3.3 мМ тирозина в составе блок-сополимера пТир6-ПЭГ43 (образец №1 в таблице 2). Оптическая плотность 4-нитрофенола при 400 нм снижалось в присутствии 30 мМ NaBH4 и pTyr-PEG@Au, тогда как в контрольном эксперименте без композитов заметного снижения поглощения 4-нитрофенола не наблюдалось в течение не менее 2 часов. Такой вид кривой типичен для данной реакции в присутствии описанных ранее катализаторов на основе благородных металлов, [ , ] Общепринятый механизм этой реакции предполагает адсорбцию обоих компонентов на поверхности катализатора, приводящую к переносу атомов водорода с ВН4- на поверхность золота. Далее, образовавшийся таким образом гидрид металла восстанавливает на поверхности нитрогруппы адсорбированного субстрата до аминогруппы с последующей десорбцией гидроксианилина (рис. 11б) Обширные исследования, опубликованные Баллауффом и его коллегами, доказали, что эта реакция описывается моделью Ленгмюра - Хиншельвуда, согласно которой кинетика реакции определяется поверхностными концентрациями адсорбированных на поверхности катализатора реакционных видов. [ ] Показано, что адсорбция 4-нитрофенолов и ионов борогидрида на поверхности металла описывается изотермой Ленгмюра - Фрейндлиха: (1) где θi,j - поверхностная концентрация компонента, Ki,j - константы адсорбции компонентов, ci,j - их объемные концентрации, а N - общее количество компонентов. Кинетика этой реакции, регистрируемая по снижению концентрации 4-нитрофенола, обычно имеет индукционный период (рис. 11а) за счет потребления кислорода, растворенного в воде, который может окислить промежуточный продукт реакции 4-нитрозофенол. Затем происходит относительно быстрое снижение оптической плотности, после чего достигается стационарная стадия реакции. (Рис. 11а) Как показали Баллауфф и его коллеги, на стационарной стадии достигается постоянная насыпная концентрация промежуточного продукта реакции 4-гидрокси-гидроксиламин. Согласно [11], расход 4-нитрофенола на стационарной стадии описывается уравнением (2). (2) где n и m - экспоненты Фрейндлиха, показывающие неоднородность 4-нитрофенольных участков адсорбции, СNp, СBH4 и KNp, KBH4 - концентрации тока и константы адсорбции 4-нитрофенола и борогидрида натрия, соответственно, kapp и kcat - наблюдаемые и элементарные константы скорости 4-нитрофенольного восстановления, а S - площадь поверхности катализатора. Как показано на рис. 11в, скорость восстановления увеличивается с увеличением концентрации катализатора. Поскольку капп зависит от стационарной концентрации реагентов, использование этих констант для сравнительной характеристики каталитической активности наночастиц не совсем однозначно. Для определения констант элементарной скорости восстановления 4-нитрофенола мы рассчитали KNp и KBH4 для 33°C, использованных в данной работе на основе значений энтальпии и энтропии адсорбции, опубликованных Вундером и др.[12] Константы адсорбции для 4-нитрофенола и борогидрида натрия составили 6922 и 69 л/моль, соответственно. Рис. 11. Кинетика восстановления 4-нитрофенола в присутствии pTyr-PEG@Au композитов. (а) Типичная кинетика 4-нитрофенолового распада в полулогарифмических координатах. Пунктирные линии указывают на стационарный сегмент, тип показывает индукционный период реакции.(б) Схема, иллюстрирующая механизм гетерогенного катализа на золотых наночастицах, предложенного в работе [12]. (в) Кинетика восстановления 4-нитрофенола в присутствии 1,045 М (1), 2,09 М (2), 4,18 М (3) и 6,27 М Au в композите pTyr6-PEG43@Au №. 1. Пунктирные кривые соответствуют численному решению уравнения (5), выполненного с помощью программы, написанной на Python 3 (г) Каталитические константы 4-нитрофенолового восстановления, катализируемые пТир6-ПЭГ43@Au No. 1 в зависимости от концентрации катализатора (нижняя ось х) и общей площади поверхности золотых наночастиц (верхняя ось х). Используя эти значения, мы предположили n = 0.6 и m = 1.0, так как аналогичные значения наблюдались при обработке кинетики восстановления, катализируемой наночастицами золота. [10, 11], мы фитировали кинетику восстановления 4-нитрофенола при различных концентрациях композита №1 уравнением (2). Для сравнения каталитической активности композитов необходимо точно знать концентрацию золота в пробах и средний размер наночастиц золота. Содержание золота в композитах, отделенного от избытка хлораурата, определяли с помощью рентгено-флуоресцентной спектрометрии с полным внешним отражением (концентрации запасных растворов композитов представлены в табл. 2). Произведение каталитической константы kкат и площади поверхности золотых наночастиц (см. уравнение 2) линейно увеличивается с концентрацией композита (рис. 11d, верхняя ось). Линейность этой зависимости указывает на то, что каталитическую активность композитов можно сравнить при фиксированной концентрации Au. Эти данные были также представлены как функция от числа средних площадей поверхности золотых наночастиц, Sn, в образце (рис. 11d, верхняя ось). Площади поверхностей композитов оценивались в предположении сферической геометрии золотых наночастиц как (3) где C(Au) - массовая концентрация золота (мг/см3), Dn¬ - среднечисловой диаметр золотых наночастиц (табл. 3) и Au - плотность золота (19.32 г/см3). Наклон этой линии дает каталитическую константу, нормированную по площади поверхности золотых наночастиц (м2/л). Полученное значение около 1.59×10-4 л×м2×с-1 было достаточно близко к ранее зарегистрированному для наночасиц золота, полученных на поликатионных щетках и углеродных нанотрубках (1.6×10-4 л×м-2×с-1) [11, ]. Каталитическую активность композитов 1-9 сравнивали при одинаковой концентрации Au(0) 4,18 мкМ. Площадь поверхности наночастиц в композитах 1-6 рассчитывалась по уравнению 3, полученному в предположении сферической геометрии наночастиц. Для расчета площади тригональных нанопластинок в образцах 7-9 использовалось уравнение 4, учитывающее массовую долю сферических частиц α и нанопластинок (1- α) в каждом образце без учета площади боковых плоскостей тонких призм. (4) Для сравнения каталитической активности различных композитов был оценен параметр kcatS с помощью программы, написанной на Python 3. Каталитическая активность образцов, полученных в присутствии каждого сополимера, увеличивается при избытке хлороаурата по сравнению с тирозином в процессе синтеза композитов. (табл. 2). В то же время на зависимость каталитической активности композитов от длины политирозинового блока сильно влиял используемый для их синтеза избыток тетрахлороаурата. При самом низком соотношении 0.2 наибольшая активность около 7×10-6 л×м-2×с-1 наблюдалась у полимера pTyr17-PEG43, однако этот эффект не наблюдался при более высоких соотношениях [Tир]/HAuCl4]. (таблица 2) Рис. 12. Кинетика восстановления 4-нитрофенола в присутствии композитов пТир-ПЭГ@Au. Зависимость каталитических констант композитов, описанных в таблице 3, от площади поверхности золотых наночастиц, измеренная при постоянной концентрации Au(0) 4.18 М. Числа на графике соответствуют образцам, описанным в таблице 2. Изображения на кривой соответствуют типичным наночастицам, полученным в образцах 7-9, 4-6 и 1-3 (соответственно, слева направо). Изучение корреляции параметра kкат×S с площадью поверхности наночастиц, определенной с помощью ПЭМ, показало, что образцы № 4-9, полученные при самой низкой и промежуточной концентрации хлороаурата, подчинялись линейной зависимости при значении коэффициента Пирсона R2, равном 0.98. Каталитическая константа, определяемая по наклону этой зависимости, составляла (0.93±0.08)×10-4 л*моль-1×с-1. Это значение в 1,6 раза меньше константы, определенной для образца № 1 из концентрационной зависимости каталитической активности. Удивительно, что каталитическая активность композитов 1-3 сильно отклоняется от этой зависимости. Представляется вероятным, что причины значительно более высокой каталитической активности этих образцов, вызванной 2-кратным превышением хлороаурата над тирозиновыми повторителями, основаны на наблюдении того, что эти образцы содержат очень мелкие наночастицы, едва различимые даже при HR-TEM (менее 2 нм). (см. вставки над кривой на рис. 10) Очевидно, что площадь поверхности таких частиц и их каталитическая активность могут быть очень высокими. Однако эти наночастицы не учитываются при расчете площади поверхности, что приводит к недооценке площади поверхности ВНП в этих образцах. Для оценки того, насколько хорошими катализаторами были получены композиты pTyr-PEG@Au, мы сравнили значения, найденные в данной работе, с рядом ранее опубликованных катализаторов на основе золотых наночастиц. Поскольку значения kкат доступны только в публикациях лаборатории М. Баллауффа, мы ограничились сравнением значений kнабл, нормализованных к площади поверхности катализатора. Принимая во внимание, что уменьшение этого значения с повышением концентрации 4-нитрофенола [11], в таблице 3 мы также привели концентрации нитрофенол, используемые в соответствующих работах,. Видно, что каталитическая активность образцов 1-3 находится в верхней части таблицы, значительно опережая цитратно- или тиол-стабилизированные наночастицы. Таблица 3. Сравнение каталитической активности композитов пТир-ПЭГ@Au с различными описанными в литературе катализаторами на основе золотых наночастиц. Стабилизатор C(Нф), мкM kнабл/S, лс-1м-2 Ссылка. PS-QDMAEMA 50 0.2230 12 Tween 80 100 0.2018 Комозит №3 50 0.1859 Эта работа Композит №2 50 0.1800 Эта работа Непокрытые частицы 50 0.1700 ПЭИ600-олеинова к-та 25 0.1667 (Au:N=1:200) Композит №1 50 0.1574 Эта работа Скуаровая кислота 140 0.1418 Композит №4 50 0.1158 Эта работа ЦТАБ 100 0.1047 Родизоновая кислота 140 0.0952 Кафеиновая кислота 100 0.0714 Композит №6 50 0.0712 Эта работа Композит №5 50 0.0596 Эта работа Лимонная кислота 25 0.0592 Крмпозит №7 50 0.0512 Эта работа Композит №9 50 0.0493 Эта работа Композит №8 50 0.0490 Эта работа ПЭГ2000-1,2,3-триазол N/Aa) 0.0430 23 Лимонная кислота 100 0.0416 23 Цитрат-наночастица+ 56 0.0295 ПГМ@РАА*HCl 1,2,3-триазол-ПЭГ N/Aa) 0.0190 23 линейный чередующийся сополимер Кроконовая кислота 140 0.0133 18 Хитозан 100 0.0125 1,2,3триазол дендример N/A a) 0.0120 23 ПЭГ-SH N/A a) 0.0030 23 ПЭГ-SH N/A a) 0.0010 23 N/A – оригинальная статья не содержит эту информацию. Исключительно высокая активность полученных композитов обусловлена относительно слабой координацией золота по остаткам тирозина. Это соображение основано на идеях, впервые высказанных в работе Ciganda et al. [ ], в которой было показано, что катализаторы на основе золотых наночастиц, стабилизированные тиолятными или цитратными лигандами, проявляют чрезвычайно низкую каталитическую активность. Позднее Gu и др. показали, что наночастицы золота без покрытия, полученные методом лазерной абляции, также проявляют чрезвычайно высокую каталитическую активность. Наши результаты согласуются с этими соображениями. Действительно, полипептидный гидрофобный блок не является хорошим координирующим агентом для ВНП, поэтому 4-нитрофенол может легко заменить его во время каталитической реакции. Все результаты этой работы показывают, что появление в образцах, произведенных в присутствии большого превышения хлороаурата над тирозином, очень мелких частиц вполне естественно. Представляется вероятным, что при проникновении HAuCl4 в полимерные мицеллы в них могут появиться области перенасыщения, т.е. области, в которых соотношение [Tyr]/[HAuCl4] заметно меньше, чем стехиометрия реакции, равная 3. В этих условиях реакция восстановления ограничивается потреблением тирозина, поэтому локальное истощение тирозина должно привести к прекращению роста семян и образованию очень мелких наночастиц. Однако эти зоны перенасыщения могут быть частично размыты в случае возможности перегруппировок в полимерной мицелле, например, в случае самого короткого полимера pTyr6-PEG43, образующего фибриллярные мицеллы с высокой доступностью звеньев тирозина (рис. 10, п. 1). Блок-сополимеры с более высоким содержанием тирозина образуют везикулы и/или наночастицы, в которых существенно снижается подвижность цепей. Поэтому в условиях большого избытка HAuCl4 реакция может прекратиться на стадии формирования зародышей в областях, пересыщенных хлороауратом. Поскольку эти зародыши очень малы, мы не смогли учесть их при определении размера и площади наночастиц. Наличие этих зон в образце 3 было доказано с помощью энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии. Мы полагаем, что присутствие очень маленьких частиц в таких композитах обуславливает их повышенную каталитическую активность. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о целесообразности использования сополимеров pTyr-PEG для получения высокоэффективных катализаторов на основе наночастиц золота. 1. V. S. Bugrin, M. Yu. Kozlov, I. I. Baskin, and N. S. Melik-Nubarov, Polymer Sci., Ser. A, 2007, 49, 463–472. 2. М.В. Китаева, Н.С. Мелик-Нубаров, А.А. Ярославов, Биол. Мембраны. 2005, 22, 118-125. 3. Romanyuk A.V., Grozdova I.D., Ezhov A.A., Melik-Nubarov N.S. Sci. Rep. 2017, 7, 3410. doi: 10.1038/s41598-017-03527-w. 4. M. R. Miah and T. Ohsaka, Electrochim. Acta, 2009, 54, 5871-5876; R.W. Murray, Chem. Rev., 2008, 108, 2688. 5. S. A. C. Carabineiro, Front. Chem., 2019, 7, 702; T. Mallat and A. Baiker, Ann. Rev. Chem. Biomol. Eng., 2012, 3, 11-28. 6. G. Li and R. Jin, J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 11347–11354. 7. M. Cortie, A. Laguna, and D. T. Thompson. Gold Bull. 2006, 39, 226. 8. M. Cano, P. Villuendas, A. M. Benito, E. P. Urriolabeitia and W. K. Maser, Mater. Today Comm., 2015, 3, 104-113. 9. A. I. Ayad, D. Luart, A. O. Dris and E. Guйnin, Nanomaterials, 2020, 10, 1169. 10. S. Gu, S. Wunder, Y. Lu, M. Ballauff, R. Fenger and K. Rademann, J. Phys. Chem. C, 2014, 118, 18618−18625. 11. S. Wunder, F. Polzer, Y. Lu, Y. Mei and M. Ballauff, J. Phys. Chem. C, 2010, 114, 8814–8820. 12. M. Cano, P. Villuendas, A. M. Benito, E. P. Urriolabeitia and W. K. Maser, Mater. Today Comm., 2015, 3, 104-113. 13. P. Suchomel, L. Kvitek, R. Prucek, A. Panacek, A. Halder S. Vajda and R. Zboril, Sci. Rep., 2018, 8, 4589. 14. S. Gu., J. Kaiser, G. Marzun, A. Ott, Y. Lu, M. Ballauff,, A. Zaccone, S. Barcikowski, P. Wagener, Catal. Lett., 2015, 145, 1105–1112. 15. L. Wang, · X. Zhang, · Y. Cui, X. Guo, S. Chen, H. Sun, D. Gao, Q. Yang and J. Kang, Transition Met. Chem. 2020, 45, 31–39. 16. N.E. Larm, J.B. Essner, K.Pokpas, J.A. Canon,N.Jahed, E.I. Iwuoha, and G.A. Baker, J. Phys. Chem.C, 2018, 122, 5105−5118. 17. R. Seoudi, D.A. Said, World J. Nano Sci. Eng.2011, 1, 51-62 18. N.E. Larm, J.B. Essner, K.Pokpas, J.A. Canon,N.Jahed, E.I. Iwuoha, and G.A. Baker, J. Phys. Chem.C, 2018, 122, 5105−5118. 19. Y. S. Seo, E.-Y. Ahn, J. Park, T.Y. Kim, J.E. Hong, K. Kim, Y. Park and Y. Park, Nanoscale Res. Lett. 2017, 12, 7, DOI 10.1186/s11671-016-1776-z 20. L. Wang, · X. Zhang, · Y. Cui, X. Guo, S. Chen, H. Sun, D. Gao, Q. Yang and J. Kang, Transition Met. Chem. 2020, 45, 31–39. 21. M. Li, G. Chen, Nanoscale,2013, 5, 11919-11927. 22. R. Seoudi, D.A. Said, World J. Nano Sci. Eng.2011, 1, 51-62 23. R. Ciganda, N. Li, C. Deraedt, S. Gatard, P. Zhao, L. Salmon, R. Hernández, J. Ruiz and D. Astruc, Chem. Commun., 2014,50, 10126-1013 |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".