Изучение особенностей биоэлектрической активности миокардиальной ткани различных структур сердца мышей C57Bl6/CBA как потенциальной животной модели суправентрикулярных аритмийНИР

Investigation of bioelectrical properties of myocardial tissue in various heart structures of C57Bl6/CBA mice as a potential animal supraventricular arrhythmia model

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 22 марта 2018 г.-19 марта 2019 г. Изучение особенностей биоэлектрической активности миокардиальной ткани различных структур сердца мышей C57Bl6/CBA как потенциальной животной модели суправентрикулярных аритмий
Результаты этапа: В соответствии с задачами, поставленными на 2018 год, при помощи стандартной микроэлектродной техники были исследованы параметры биоэлектрической активности в препаратах миокардиальной ткани желудочка, левого предсердия и легочных вен у трех поколений мышей: родительских особей линий C57Bl/6 (самцы) и CBA (самки), потомства F1 C57Bl/6/CBA, и потомства F2 C57Bl/6/CBA (все мыши были массой 25-40 г.). В работе были использованы 3 типа многоклеточных препаратов: легочные вены (ЛВ), ушко левого предсердия (ЛП) и правый желудочек (ПЖ). Следует отметить, что в работе нами был использован препарат правого желудочка, а не левого, как изначально было заявлено в проекте, по причине нежизнеспособности препарата левого желудочка в условиях нашего эксперимента. Изначально было проведено несколько экспериментов на препаратах левого желудочка, но зарегистрировать в нем ПД нам не удалось. Препараты работали в двух режимах: (1) в навязанном ритме (при электрической стимуляции - частота 5 Гц, длительность импульса - 2 мс, амплитуда - 3-10 В) и (2) без стимуляции, такие препараты называли «покоящимися». Указанные два режима работы тканевых препаратов моделируют (1) «естественные» условия, когда ткань находится под ритмическим контролем ритмоводителя, а также (2) «патологические» условия, когда возбуждение ткани импульсами ритмоводителя заблокировано. В стимулируемых препаратах оценивали значения длительности потенциалов действия на уровне 90 и 50% реполяризации (ДПД90% и ДПД50%) а также значения потенциала покоя (ПП), в нестимулируемых - значения ПП, а также наличие и характер спонтанной активности. Значения ДПД90% и ДПД50% в электрически стимулируемых препаратах ЛВ, ЛП и ПЖ у мышей трех поколений (линий C57Bl/6 и CBA – родительские особи, потомства F1 C57Bl/6/CBA и потомства F2 C57Bl/6/CBA) представлены в таблицах 1-1, 1-2. Нами не было выявлено статистически значимых различий в значениях ДПД в миокарде ЛВ (ЛП/ПЖ) между различными типами мышей. Также мы регистрировали значения ПП как в стимулируемых, так и в покоящихся препаратах миокарда ЛВ, ЛП и ПЖ. В стимулируемых препаратах миокарда ЛВ всех трех поколений мышей не было обнаружено статистически значимых различий в значениях ПП: у мышей линии C57Bl/6 он составил -79±4 мВ (n=4), у мышей линии CBA -78±2 мВ (n=5), у гибридов первого поколения F1 -75±3 мВ (n=5), у F2 -78±2 мВ (n=5). При отключении стимуляции деполяризацию потенциала покоя наблюдали у мышей линии CBA, в этом случае ПП достигал значений -67±2 мВ (n=5), а также в части препаратов (3 из 5) мышей линии C57Bl/6 (родительские особи, самцы). В среднем ПП в ЛВ мышей линии C57Bl/6 достигал значений-73±3 мВ (n=5). У мышей гибридов F1 и F2 такой спонтанной деполяризации не наблюдали. ПП у них составил-75±2 мВ (n=4), -75±3 мВ (n=5) и -76±2 мВ (n=5), соответственно (Рис.1-1). В стимулируемых препаратах ЛП мышей всех трех поколений не было выявлено статистически значимых различий в значениях ПП (Рис. 1-2): у мышей линии C57Bl/6 он составил -79±5 мВ (n=5), у мышей линии CBA -79±3мВ (n=5), у гибридов первого поколения F1 -75±4 мВ (n=10), у F2 -77±2 мВ (n=4). В покоящихся препаратах левого предсердия ПП статистически значимо отличался (от соответствующих значений в стимулируем препаратах) только у мышей линии CBA: он достигал значений -69±2 (n=5). В остальных случаях ПП оставался стабильным и составил у мышей линии C57Bl/6 -78±5 мВ, у гибридов F1 -72±6 мВ (n=9), у F2 -73±7 мВ (n=4). Таким образом, в препаратах ЛП только мышей линии СВА мы наблюдали спонтанную деполяризацию ПП. В стимулируемых препаратах ПЖ, так же, как и в нестимулируемых препаратах не наблюдали никаких статистически значимых различий в значения ПП между мышами трех поколений (Рис. 1-3). Таким образом, в данном типе препаратов у всех поколений мышей потенциал покоя был стабильным и не подвергался спонтанной деполяризации после отключения ритмической стимуляции препарата. Таким образом, нами впервые был проведен сравнительный анализ значений ПП в стимулируемых и нестимулируемых препаратах ЛВ, ЛП и ПЖ у мышей трех поколений. В покоящихся препаратах ЛВ родительских особей (мышей линий C57Bl/6 и СВА) наблюдали характерную для большинства изученных млекопитающих деполяризацию ПП, тогда как у гибридов F1 и F2 ПП оставался гиперполяризованным. Возможно, это обусловлено различным уровнем экспрессии каналов, переносящих ток IK1, который определяет уровень потенциала покоя. На следующем этапе нашей работы мы определяли способность к формированию спонтанной автоматической активности в нестимулируемых препаратах ЛВ, ЛП и ПЖ у мышей всех трех поколений мышей в базальных условиях, то есть без действия каких-либо веществ (обобщенные данные приведены в таблице 1-3). Мы выяснили, что в покоящихся препаратах ЛВ регулярная спонтанная активность развивалась у всех видов мышей, кроме материнских особей линии CBA, однако, в отличие от гибридов F1 и F2, у мышей линии C57Bl/6 такая спонтанная автоматическая активность развивалась крайне редко. Кроме того, у мышей F1 и F2 такие спонтанные ПД в части экспериментов сопровождались ранними постдеполяризациями (Рис. 1-4). Спонтанная автоматическая активность развивалась в течение 10-60 с после прекращения стимуляции препарата и поддерживалась на протяжении всего времени отсутствия стимуляции. В покоящихся препаратах ЛВ мышей линии C57Bl/6 в 40% случаев (n=5) развивалась спонтанная автоматическая активность (в одном из этих препаратов наблюдали ПД с ранними постдеполяризациями), при этом ПП оставался на гиперполяризованном уровне, а в остальных 60% препаратов наблюдалась спонтанная деполяризация потенциала покоя без развития какой-либо активности. У гибридов F1 спонтанная автоматическая активность развивалась в 80% препаратов ЛВ, 55% из них имели ПД с ранними постдеполяризациями. У гибридов F2 спонтанная автоматическая активность развивалась в 90% случаев (n=6), в 60% из которых наблюдали ПД с постдеполяризациями. У мышей линии СВА при прекращении стимуляции наблюдали исключительно развитие деполяризации ПП, без формирования какой-либо регулярной автоматической активности. В покоящихся препаратах ЛП мышей наблюдали развитие спонтанной автоматической активности у всех типов мышей, кроме материнских особей линии СВА (Рис.1-5). Однако у мышей линии C57Bl/6 такая активность возникала реже, чем у гибридов F1 и F2: только в 50% препаратов (n=6), тогда как у гибридов F1 и F2 в 80% препаратов (n=18 и n=6, соответственно). Такая активность возникала либо сразу после прекращения стимуляции, либо в течение первых 60 сек и сохранялась на протяжении всей записи, то есть во время всего периода отсутствия электрической стимуляции. Кроме того, в некоторых случаях у мышей F1 C57Bl/6/CBA спонтанные ПД сопровождались постдеполяризациями (в 4 препаратах из 14). В покоящихся препаратах ПЖ нами также была обнаружена спонтанная автоматическая активность, причем у всех типов мышей (в 80% препаратов каждого из типов мышей). Спонтанные потенциалы действия появлялись сразу после прекращения стимуляции, имели регулярный характер и поддерживались на протяжении всего периода отсутствия стимуляции. Частота такой спонтанной активности была от 4 до 8 Гц. Возможно возникновение такой активности связано с тем, что в препаратах ПЖ содержатся элементы проводящей системы сердца, которые при определенных условиях могут генерировать собственный ритм, поэтому такая активность не рассматривалась нами как эктопическая. Таким образом, нами было впервые показано, что миокард не только ЛВ, но и ЛП гибридов F1 C57Bl/6/CBA, а также гибридов F2 C57Bl/6/CBA склонен к эктопической автоматии и/или аномалиям реполяризации ПД триггерного характера, служащим обычно основой формирования ФП у крупных млекопитающих и человека. Согласно нашим представлениям и данным литературы, спонтанная активность и аномалии реполяризации ПД в нормальных условиях (то есть без адренергической/симпатической стимуляции) ранее не были показаны ни для одной из линий мышей. Для оценки влияния адренергической стимуляции на способность к формированию спонтанной активности в препаратах ЛВ, ЛП и ПЖ мы использовали норадреналин (НА – неселективный агонист адренорецепторов) а также блокатор β-адренорецепторов пропранолол (5 мкМ). Препараты в отсутствие стимуляции перфузировали раствором, содержащим 10 мкМ НА в течение 10-15 минут, регистрировали изменения мембранного потенциала в течение всего времени записи. Обобщенные данные по характеру действия НА на препараты ЛВ, ЛП и ПЖ у трех поколений мышей представлены в таблице 1-3. В препаратах ЛВ всех исследуемых типов мышей НА вызывал перманентную (сохраняющуюся на протяжении всего эксперимента) спонтанную активность регулярного или пачечного характера. В том случае, если в препаратах ЛВ исходно присутствовала спонтанная автоматическая активность, действие НА приводило к изменению характера следования ПД и увеличению частоты. То есть, например, если изначально, в базальных условиях в препарате наблюдали спонтанную автоматическую активность регулярного характера, то при действии НА она приобретала пачечный характер. Возникновение ПД с ранними постдеполяризациями при действии НА не было обнаружено, даже если они присутствовали изначально (Рис. 2-1, табл 1-3.). В препаратах ЛП у мышей линии C57Bl/6, гибридов F1 C57Bl/6/CBA и F2 C57Bl/6/CBA действие НА либо приводило к возникновению спонтанной активности в тех препаратах, в которых ее не было изначально, в базальных условиях, либо вызывало изменение характера спонтанной автоматической активности (Рис. 2-1, Табл. 1-3). В покоящихся препаратах мышей линии CBA НА ни в одном из препаратов не вызывал спонтанной активности, а также не приводил к каким-либо изменениям мембранного потенциала. В препаратах ПЖ у всех трех поколений мышей НА действовал сходно: он вызывал спонтанную активность в том случае, если ее не было изначально, и изменял характер и частоту спонтанной автоматической активности, когда она была изначально в покоящихся препаратах. В ходе выполнения работ по проекту нами также был использован блокатор β-адренорецепторов (пропранолол, 5 мкМ), его подавали на фоне НА в течение 5-10 минут. Во всех типах препаратов у всех трех поколений мышей пропранолол действовал одинаково: он полностью блокировал действие НА. То есть он приводил либо к полному прекращению спонтанной активности, вызываемой НА (в случае, если изначально в базальных условиях в препаратах не было спонтанной автоматической активности), либо к изменению характера и частоты спонтанной активности с тех, которые были при действии НА на те, которые были изначально в базальных условиях. На следующем этапе работы оценивали действие селективных блокаторов hERG K+ каналов, переносящих ток IKr (дофетилид, 5 нМ, являющийся антиаритмическим препаратом III класса, и Е-4031, 5 нМ) на спонтанную активность, вызываемую норадреналином в покоящихся препаратах (1), а также на параметры ПД в стимулируемых препаратах (2) ЛВ, ЛП и ПЖ всех типов мышей. 1. Ни один из блокаторов не влиял на параметры спонтанной активности, вызываемой НА ни в одном из типов препаратов у всех трех поколений мышей. 2. Также ни дофетилид, ни Е-4031 значимо не изменяли ДПД90% и ДПД50% ни в одном из типов препаратов у всех трех поколений мышей. Исходя из таких результатов можно заключить, что у мышей линий C57Bl/6 и СВА, а также у гибридов F1 C57Bl/6/CBA и F2 C57Bl/6/CBA ток IKr, характерный для неонатального миокарда грызунов, не сохраняется у взрослых мышей изучаемых типов и не вносит значимого вклада в формирование спонтанной активности, а также в конфигурацию ПД в препаратах ЛВ, ЛП и ПЖ. В соответствии с планом работ на следующем этапе нами были проведены эксперименты по регистрации ЭКГ у мышей линий C57Bl/6 и CBA, потомства F1 C57Bl/6/CBA, и потомства F2 C57Bl/6/CBA. ЭКГ регистрировали с помощью поверхностных электродов, подключенных к усилителю PL3516 PowerLab 16/35, Animal Bio Amp (IDInstruments, USA) в отведении, эквивалентном II отведению по Эйнтховену. Запись и анализ сигнала осуществляли при помощи программного обеспечения LabChart Pro (IDInstruments, USA). При анализе ЭКГ оценивали следующие параметры: ЧСС (частота сердечных сокращений, уд/мин, рассчитывали на основе длительности RR-интервалов); RMSSD - показатель, характеризующий вариабельность ритма, с помощью данного показателя можно выявить нерегулярность длительности RR-интервала; длительность Р зубца (мс), который отражает время деполяризации предсердий; интервал PR (мс), соответствующий общему времени атрио-вентрикулярного проведения; QRS (мс) – время, деполяризации желудочкового миокарда; интервал QT (мс), соответствующий продолжительности деполяризации желудочкового миокарда. Также оценивали наличие или отсутствие нарушений ритма. Соответствующие результаты представлены на рис. 3-1. Статистически значимых различий в значениях ЧСС у мышей всех трех поколений обнаружено не было. Так, у мышей линии C57Bl/6 ЧСС составила 560±44 уд/мин (n=4), у мышей линии CBA 584±32 уд/мин (n=5), у F1 C57Bl/6/CBA 596±43 уд/мин (n=8), и потомства F2 C57Bl/6/CBA 610±43 уд/мин (n=4). В значениях таких параметров ЭКГ, как RMSSD, длительность QRS комплекса, длительность QT интервала статистически значимых различий между исследуемыми типами мышей также обнаружено не было (данные представлены на рис.3-1). Статистически значимые различия были обнаружены только в длительности Р зубца между мышами линии C57Bl/6 и гибридами F2 C57Bl/6/CBA (17,6±2 мс (n=4) и 11,9±2 мс (n=4), соответственно), а также в длительности PR-интервала. Так, у мышей линии C57Bl/6 она составила 47,1±4 мс (n=4), что статистически значимо отличалось от значений данного параметра у других типов мышей: мышей линии СВА - 35,6±3 (n=5), F1 C57Bl/6/CBA - 34,3±2 (n=8), F2 C57Bl/6/CBA - 38,6±3(n=4). Однако данные различия не являлись критическими. Следует отметить, что в наших экспериментах ЭКГ у всех типов мышей не имела ярко выраженных изменений и отклонений от нормы, каких-либо нарушений ритма: во всех записях были видны зубец P, QRS-комплекс и T волна. Возможно, что эктопическая автоматия оказывается подавлена при ритмическом воздействии со стороны пейсмекера сердца, и не проявляется у здоровых животных без дополнительных патологических воздействий.
2 26 июня 2019 г.-10 марта 2020 г. Изучение особенностей биоэлектрической активности миокардиальной ткани различных структур сердца мышей C57Bl6/CBA как потенциальной животной модели суправентрикулярных аритмий
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы

№ Имя Описание Имя файла Размер Добавлен
1. Файл, содержащий рисунки, отражающие основные результаты работы по проекту Prilozhenie_1__fajl_s_risunkami.pdf 1,1 МБ 27 марта 2020 [karimovaVika]