![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ЦЭМИ РАН |
||
Адресная доставка лекарственных препаратов, нековалентно иммобилизованных на поверхности магнитных наночастиц, в злокачественные новообразования является крайне актуальной задачей. В результате выполнения проекта будет полностью установлен сценарий поведения комплекса «наночастица-действующее вещество» от момента введения в организм до момента проникновения в опухоль. Это будет сделано с использованием димерных наночастиц магнетит-золото как платформы для доставки, дающей уникальную возможность отслеживать судьбу как самого носителя (меченого флуоресцентным красителем на наночастице золота), так и действующего вещества (также обладающего флуоресцентными свойствами), загруженного в полимерную оболочку на поверхности наночастиц магнетита. Поскольку наночастицы и действующее вещество могут быть визуализированы независимо друг от друга, будет дан однозначный ответ на вопрос, действительно ли наночастицы и загруженный на них препарат доходят до целевой ткани в неизменном виде, либо же высвобождение препарата начинается ранее (в том числе, в кровотоке). В совокупности это позволит верифицировать и усовершенствовать подходы к доставке как гидрофобных, так и гидрофильных лекарственных препаратов, загруженных в полимерную оболочку на поверхности магнитных наночастиц.
Targeted delivery of drugs that are non-covalently immobilized on the surface of magnetic nanoparticles, into malignant neoplasms is an extremely urgent task. As a result of the project, the scenario of "nanoparticle-active substance" complex behaviour from the moment of intravenous injection until the moment of penetration into the tumor tissue will be fully established. This will be done with the use of magnetite-gold dimeric nanoparticles as a platform for delivery, giving a unique opportunity to track the fate of both the carrier (labelled with a fluorescent dye on the gold nanoparticle) and the active substance (also possessing fluorescent properties) loaded into the polymeric shell on the surface of magnetite nanoparticles. Since the nanoparticles and the active substance can be visualized independently of each other, an unambiguous answer will be given to whether the nanoparticles and the drug loaded on them reach the target tissue unchanged, or whether the release of the drug begins earlier (including in the blood stream). All together, this will allow verifying and improving the approaches to the delivery of both hydrophobic and hydrophilic drugs loaded into the polymer shell on the surface of magnetic nanoparticles.
В результате выполнения проекта будет полностью установлен сценарий поведения комплекса «НЧ-действующее вещество» от момента введения в организм до момента проникновения в опухоль. Поскольку НЧ и действующее вещество могут быть визуализированы независимо друг от друга, будет дан однозначный ответ на вопрос, действительно ли НЧ и загруженный на них препарат доходят до целевой ткани в неизменном виде, либо же высвобождение препарата начинается ранее (в том числе, в кровотоке). В совокупности это позволит верифицировать и усовершенствовать подходы к доставке как гидрофобных, так и гидрофильных лекарственных препаратов, загруженных в полимерную оболочку на поверхности магнитных НЧ.
Руководитель проекта, Ефремова М.В. имеет пятилетний опыт синтеза, физико-химической характеризации и МРТ-тестирования магнитных НЧ. К настоящему времени Ефремовой М.В. была оптимизирована методика синтеза димерных НЧ магнетит-золото, позволяющая воспроизводимо получать НЧ требуемого диаметра от 10 до 25 нм (дополнительный файл, рис. 1а). Были получены уникально высокие контрастные свойства НЧ размером 20±5 нм, а именно R2 релаксивность = 494 мм-1с-1 (Efremova et al., Small, submitted, рис. 1б). В составе коллектива есть опытный специалист по культивированию клеток и методам клеточной биологии (Гаранина А.С.), который обеспечит ведение опухолевых клеточных линий и тестирование магнитных наночастиц in vitro. Кроме того, Анастасия владеет методами in vivo исследований (МРТ, IVIS, ИВМ), что позволит провести анализ поведения НЧ в живом организме и изучить влияние на него НЧ. К настоящему времени коллективом проекта была продемонстрирована возможность визуализации НЧ in vitro путем внедрения на поверхность флуоресцентного красителя Cy5 (Machulkin et al., Bull Exp Biol Med. 2016, рис. 1в). Получены предварительные данные о визуализации НЧ, меченых Cy5, in vivo, и показана возможность их накопления в опухоли аденокарциномы молочной железы 4T1 методами IVIS и ИВМ (рис. 1г). Имеются предварительные данные о цитотоксичности, динамике накопления и локализации димерных НЧ в клетках опухолевых линий мыши и человека, а также данные по биораспределению данных частиц в организме мышей после внутривенного введения (IVIS, МРТ).
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 25 марта 2018 г.-19 марта 2019 г. | Гибридные наночастицы магнетит-золото для исследования процессов доставки противоопухолевых препаратов |
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта методом термического разложения Fe(CO)5 в присутствии предварительно синтезированных зародышей Au синтезированы димерные наночастицы (НЧ) магнетит-золото и охарактеризованы методом просвечивающей электронной микроскопии, в том числе, высокого разрешения. НЧ магнетита имели ярко выраженную октаэдрическую форму с диагональю 25±5 нм, а НЧ золота – сферическую форму с диаметром 9±2 нм. НЧ были покрыты полимерной оболочкой из амфифильных полимеров DSPE-PEG/ Pluronic F127, после чего их гидродинамический радиус и дзета потенциал составлял 60±3 нм/ 71±8 нм и -19±3/-15±3 мВ, соответственно. НЧ были функционализованы флуоресцентным красителем Sulfo-Cy5, содержащим S-S фрагмент, селективно и ковалентно связывающийся с НЧ золота в составе димерной структуры. Разработана и оптимизирована методика селективной загрузки гидрофобного препарата нильского красного (Nile Red) и коммерческого противоопухолевого препарата доксорубицина (DOX), в полимерную оболочку на НЧ Fe3O4 и наличием сигнала как флуоресцентной метки, так и действующего вещества. Загрузка препаратов составляла 86 мкг Nile Red и 285 мкг DOX на 1000 мкг Fe3O4, гидродинамический радиус НЧ оставался при этом менее 100 нм (86 ± 7 нм для NRed-НЧ-Cy5, 99 ± 10 нм для DOX-НЧ-Cy5). Подтверждено наличие рекордных МРТ-контрастных свойств НЧ c R2-релаксивностью 498,1 мМ-1с-1 и 276,9 мМ-1с-1 в воде и клетках 4Т1, соответственно. Токсичность НЧ была исследована in vitro на культурах клеток аденокарциномы молочной железы 4T1 и карциномы толстой кишки CT-26. Методом стандартного MTS-теста показано, что сами НЧ, связанные с флуоресцентной меткой Cy5, не оказывают токсического воздействия (выживаемость клеток более 90% по сравнению с контролем). Аналогичный результат был получен и NRed-НЧ-Cy5, что можно объяснить отсутствием цитотоксичности самого Nile Red как фотосенсибилизатора, активируемого лишь в присутствии внешнего излучения. Напротив, DOX-НЧ-Cy5 проявили дозозависимую токсичность как для клеток линии 4T1, так и для клеток линии CT-26 после 48 ч совместной инкубации, однако меньшую по сравнению со свободным DOX (IC50 = 1,2 мкМ/ 7,9 мкМ для свободного DOX и 4 мкМ/ 76 мкМ для DOX в образце DOX-НЧ-Су5 для клеток 4Т1/ CT-26, соответственно). Методом флуоресцентной микроскопии изучены процессы интернализации НЧ, DOX и Nile Red в клетках. НЧ с меткой Cy5 обнаруживаются в цитоплазме уже спустя 30 мин после добавления к клеткам, спустя 6 часов их количество увеличивается. Предположительно, механизмом захвата НЧ клетками является эндоцитоз. В случае интернализации НЧ, загруженных препаратами, наблюдалось постепенное увеличение интенсивности флуоресценции Nile Red/ DOX внутри клеток. В начальные моменты времени флуоресцентный сигнал Cy5 (соответствовал локализации НЧ) и флуоресцентные сигналы Nile Red/ DOX были ко-локализованы. С течением времени происходило высвобождение препаратов, но при этом их локализация была различна. Для обоих типов клеток Nile Red был диффузно расположен в цитоплазме в виде гранул, предположительно, концентрируясь в липофильных компартментах клеток и/ или эндолизосомах. В то же время, высвобождение DOX из НЧ вело к интенсивному накоплению препарата в ядре обоих типов клеток, возрастающему с течением времени. Таким образом, при инкубации в культуральной среде DOX-НЧ-Cy5 удерживают загруженный DOX до момента интернализации клетками с последующим высвобождением лекарственного средства при попадании НЧ в среду с низким рН (например, в эндолизосомы), после чего препарат попадает в ядро. Полученные данные свидетельствуют о том, что димерные НЧ магнетит-золото, покрытые полимерной оболочкой, могут быть использованы для доставки в клетки опухоли как гидрофильных, так и гидрофобных агентов. На следующем этапе проекта данные процессы будут исследованы in vivo на модели опухоли мыши. | ||
2 | 20 марта 2019 г.-19 марта 2020 г. | Гибридные наночастицы магнетит-золото для исследования процессов доставки противоопухолевых препаратов |
Результаты этапа: На этапе 2 проведено тестирование флуоресцентно меченых димерных НЧ магнетит-золото, загруженных препаратами (Nile Red, DOX) in vivo на моделях мышей породы BALB/c с подкожно привитой опухолью аденокарциномы молочной железы мыши 4T1. Методами флуоресцентной и интравитальной микроскопии показано, что НЧ стабильно циркулируют в кровеносных сосудах без признаков агрегации, как минимум, в течение первого часа после внутривенного введения, давая устойчивый флуоресцентный сигнал за счет метки Сy5. Методом ИВМ визуализирована экстравазация действующего вещества (Nile Red) в опухоли в режиме реального времени. Показано, что с момента введения и до момента интернализации НЧ в опухоли наблюдается колокализация флуоресцентных сигналов Cy5 и Nile Red, что говорит об устойчивости комплекса «НЧ-действующее вещество». Высвобождение Nile Red из НЧ в микроокружение опухоли удалось визуализировать в режиме реального времени - в течение 2 мин после прикрепления NRed-НЧ-Cy5 к стенке сосуда краситель диффундирует в окружающую сосуд опухолевую ткань. Спустя 6 ч после внутривенного введения NRed-НЧ-Cy5 флуоресцентные сигналы обоих красителей детектировались в опухоли, однако их ко-локализации не наблюдалось, вследствие высвобождения Nile Red с поверхности НЧ. Методами элементного анализа, спектроскопии поглощения, а также флуоресцентной микроскопии изучена фармакокинетка НЧ, загруженных DOX, в крови в течение суток после внутривенного введения. Показано, что количества как НЧ, так и действующего вещества, циркулирующих в кровотоке, практически постоянны в течение первого часа после инъекции как в плазме, так и в форменных элементах, снижается к 6 часу и не детектируется спустя сутки после инъекции (вследствие накопления в опухоли и захвата органами ретикулоэндотелиальной системы). Анализ соотношения DOX/ НЧ показывает, что оно лишь незначительно снижается по отношению к изначальному. Показано, что спустя 24 часа после внутривенного введения основное накопление НЧ происходит в печени, опухолях и селезенке, при этом за счет пассивного накопления вследствие EPR-эффекта 3 % от введенной дозы НЧ достигает опухоли. Данная величина в три раза выше, чем средний показатель эффективности для пассивной доставки НЧ в мировой литературе по данной проблеме. Дополнительно эффективность доставки и накопления НЧ в опухоли изучена при помощи магнитно-резонансной томографии до, а также спустя 30 мин, 6 ч и 24 ч после введения НЧ. Через 30 мин после инъекции НЧ накопление последних обнаружено, в основном, в печени, в более поздние моменты времени (6 ч и 24 ч) отчетливо наблюдается усиление контраста опухоли. Пик накопления НЧ в опухолях выявлен спустя 6 ч после введения, что также подтверждено данными IVIS. По результатам работы оптимизирована комбинация методов, дающая полную картину доставки НЧ в опухоли 4T1 и высвобождения действующего вещества in vivo. При этом система на основе димерных НЧ Fe3O4-Au, покрытых полимерной оболочкой DSPE-PEG, является оптимальной для доставки гидрофобных лекарств in vivo, удерживая загруженный препарат при циркуляции в кровотоке до момента интернализации в опухоли. В результате выполнения проекта полностью установлен сценарий поведения комплекса «наночастица-действующее вещество» от момента введения в организм до момента проникновения в опухоль. Для этого как как платформа для доставки использованы димерные наночастицы магнетит-золото, дающие уникальную возможность отслеживать судьбу как самого носителя (меченого флуоресцентным красителем Сy5 на наночастице золота), так и действующего вещества (противоопухолевого препарата доксорубицина или красителя нильского красного, являющегося моделью гидрофобного лекарства, которые также обладают флуоресцентными свойствами), которые было загружено в полимерную оболочку на поверхности наночастиц магнетита. Поскольку наночастицы и действующее вещество могут быть визуализированы независимо друг от друга, установлено, что наночастицы и загруженный на них препарат доходят до целевой (опухолевой) ткани в неизменном виде, высвобождения препарата в кровотоке не происходит. Показано, что при внутривенном введении комплекс "наночастица-действующее вещество" эффективно накапливается в опухоли (3% от введенной дозы), что превышает медианное (из литературы) значение для пассивной доставки. Таким образом, система на основе димерных НЧ Fe3O4-Au, покрытых полимерной оболочкой, является оптимальной для доставки гидрофобных лекарств in vivo, удерживающими загруженный препарат при циркуляции в кровотоке до момента интернализации в опухоли. Многообещающей перспективой в этом направлении является сочетание на НЧ молекул лекарств и низкомолекулярных лигандов с клеточным рецепторам (например, низкомолекулярных лигандов простат-специфического мембранного антигена, ПСМА), что в перспективе позволит использовать полученные биоконъюгаты для адресной доставки лекарств к конкретным клеткам. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".